Conception et synthèse de dérivés du benzènesulfonamide en tant qu’inhibiteurs puissants de l’hémagglutinine anti-influenza

En tant que genre de la famille des Orthomyxoviridae, les virus de la grippe A ont huit génomes d’ARN segmentés et sont les pathogènes humains les plus virulents parmi les trois. types de virus de la grippe. Grâce à la dérive génétique fréquente et au réassortiment de différentes souches virales, les virus grippaux A accumulent rapidement et continuellement des mutations pour échapper aux immunités dominantes dans la population générale. Les virus grippaux A provoquent non seulement des épidémies saisonnières en hiver, mais sont également capables de déclencher une pandémie majeure avec une mortalité et une morbidité plus grandes. Dans la plus récente pandémie de grippe, la souche A / H1N1 de 2009 a probablement émergé d’un réassortiment génétique de souches humaines, porcines et aviaires2. Au-delà des épidémies de grippe saisonnière et de la récente pandémie de grippe H1N1, il y a eu aussi des inquiétudes. souches de grippe aviaire H5N1 létale et la possibilité de percée des interspécies et des barrières de transmission interhumaines à travers des mutations génétiques virales, qui pourraient avoir un effet dévastateur sur la santé publique3. Actuellement, la prévention et le traitement de l’infection influenza A reposent sur la vaccination et un nombre limité d’antiflu. les médicaments qui inhibent deux cibles virales, le canal ionique M2 et la neuraminidase. L’amantadine et la rimantadine bloquent le canal ionique M2 mais ont une utilisation clinique limitée en raison de l’émergence rapide de la pharmacorésistance.4 Parmi les inhibiteurs de la neuraminidase commercialisés, l’oseltamivir est le seul médicament oral largement utilisé pour le traitement de la grippe.Néanmoins, la souche H1N1 résistante à l’oseltamivir récemment apparue pendant la saison grippale de 2008 est préoccupante.5 Compte tenu de la menace persistante que représentent les virus grippaux A pour le public, il est urgent de développer de nouvelles Comme avec de nombreux autres virus enveloppés, la fusion membranaire du virus de la grippe avec une cellule hôte est un processus biologique clé nécessaire à la libération réussie du génome viral dans le cytoplasme.6 L’hémagglutinine (HA), l’une des protéines de l’enveloppe de la grippe, est une glycoprotéine semblable à un champignon à la surface des virus qui joue un rôle central dans la reconnaissance des cellules hôtes et la fusion membranaire. Il a longtemps été considéré comme une cible potentielle pour les traitements anti-grippaux. La région de tige de HA est génétiquement stable parmi les 16 sous-types HA, et constitue la machinerie de fusion de noyau qui subit des réarrangements structurels irréversibles et facilite la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane de l’endosome de la cellule hôte. Il a récemment été démontré que des anticorps monoclonaux humains se liant à la région de tige de HA sont capables d’inhiber le processus de fusion et de démontrer des activités à large spectre contre les virus de la grippe A du groupe phénotype HA, incluant les souches H1N1 et aviaire H5N1. stratégies de vaccination basées sur la séquence consensus de HA, il y a eu un intérêt particulier dans l’identification et le développement de nouveaux inhibiteurs de HA à petites molécules ainsi que des anticorps contre une grande variété de virus grippaux.9 Le développement d’inhibiteurs HA de petites molécules biodisponibles par voie orale, spécialement ceux la région de la tige conservée de HA, devrait avoir une valeur énorme pour le traitement des infections grippales pharmacorésistantes. De nombreux inhibiteurs de HA à petites molécules tels que le cis-2-hydroxy-N- (5-hydroxy-1,3,3-triméthyl-cyclohexylméthyl) -benzamide (1), 10 ester de podocarpate (2), 11 analogue de triperidène (3), 12 et 1-phényl-cycloalcane carbamide (4) 13 ont été impliqués pour avoir des effets anti-grippaux potentiels en stabilisant la structure HA et en empêchant son changement conformationnel au cours du processus de fusion membranaire (Figure 1) .1). Sur la base des études de marquage d’affinité et des prédictions d’amarrage, 1 et ses analogues ont été déclarés se lier à une poche hydrophobe dans la région de tige de HA et ont démontré une bonne activité anti-influenza.14 Dans cette étude, nous visons à identifier HA inhibiteurs avec 1 comme point de départ et adresser les passifs potentiels DMPK du groupe fonctionnel salicylamide. Notre structure préliminaire et les études de relation d’activité (SAR) de 1 ont suggéré que le groupe salicylamide est plus important pour le contrôle conformationnel de la molécule par rapport à un rôle dans la liaison hydrogène potentiel avec la protéine HA. Ainsi, nous avons conçu des analogues cyclisés, tels que la 1H-indazol-3-ylamine 7, qui pourrait imiter la structure du salicylamide tout en conservant une activité antivirale et présentant une meilleure stabilité métabolique que 1. ont exploré d’abord les dérivés aryliques bicycliques tout en maintenant constant le groupe amino cis-aliphatique. La synthèse de 7 a été réalisée à partir de cis-amine 5 (10) comme indiqué dans le schéma 1. Brièvement, la réaction de couplage de l’acide 5 et 2-fluorobenzoïque avec HATU a donné l’intermédiaire amide, qui a ensuite été traité avec le réactif de Lawesson On a chauffé un mélange de 6 et d’hydrate d’hydrazine dans du DMSO à 150 ° C pour obtenir l’analogue d’indazole conçu 7. On a évalué son activité anti-grippale dans le dosage CPE en utilisant le rein de Darby Madin ( MDCK). L’indazole 7 s’est avéré capable d’inhiber la replication de la souche grippale A / Weiss / 43 et d’empêcher l’effet cytopathique viral avec une CE50 de 6,9 ​​& ggr; M (tableau 1). Parce que 7 a également démontré une amélioration de la stabilité microsomique hépatique chez la souris (MLM = 45,2 mL / min / kg) comparativement à 1 (MLM = 76,7 mL / min / kg) 15, il a été utilisé comme matrice pour d’autres modifications structurales. Pour tester l’influence de la géométrie et du schéma de substitution des anneaux aromatiques sur l’activité antivirale, les analogues ont été préparés par remplacement nucléophile de divers composés bicycliques. les chlorures d’aryle avec l’amine 5 dans la pyridine. Ces analogues aromatiques bicycliques ont été testés pour leur puissance antivirale et leur cytotoxicité dans des cellules MDCK en utilisant le test CPE. Il est rapidement apparu que les analogues avec des remplacements de quinazoline ou de benzothiazole ont une activité modérée, et la substitution sur les groupes aromatiques n’est généralement pas tolérée, laissant ainsi peu d’espace pour d’autres optimisations structurales. Par exemple, l’analogue 11 avec substitution 6-Cl était inactif dans le test CPE, mais 9 et 10 (R = H et F) ont montré une CE50 autour de 2 μ M.En outre, de nombreux analogues ont une fenêtre de sélectivité marginale et une clairance intrinsèque élevée, probablement due à une hydrophobicité accrue. Par conséquent, de nouvelles matrices avec un anneau moins lipophile comme la pyridine ou le phényle ont été synthétisées pour évaluer la possibilité d’augmenter la puissance et la stabilité métabolique. Parmi les analogues d’aminopyridine, 14 avec 6-CF3 est plus de 15 fois plus puissant que les analogues 12 et 13 mauvaise stabilité microsomale. La synthèse des analogues de l’aniline 15 a été réalisée par le couplage croisé catalysé par le cuivre des bromures de phényle substitués avec 5.16. Les analogues de l’aniline 17 et 20 avec des groupes de substitution 3-Cl et 3-CF3 ont démontré de meilleures propriétés antivirales. une CE50 de 57 et 42 nM, respectivement (voir 12 – 20). Quand un second petit groupe hydrophobe a été introduit, il a donné des analogues très puissants 22 et 23 avec EC50 en dessous de 20 nM. Les deux groupes hydrophobes encombrants et les substituants polaires tels que les amides ont aboli l’activité anti-grippale. D’autres explorations chimiques ont conduit au sulfonamide 28, qui présentait des activités antivirales submicromolaires et une bonne fenêtre de sélectivité dans les cellules MDCK. Comparé à d’autres dérivés, 28 a également montré une bonne solubilité dans l’eau (141 μ g / mL dans un tampon phosphate, pH 6,5) et une stabilité significativement améliorée dans les microsomes hépatiques humains et de souris avec HLM de 6,6 mL / min / kg et MLM Sur la base de l’analyse SAR et des métabolites de la série aniline, des analogues disubstitués du benzènesulfonamide ont été conçus et synthétisés (Schéma 2). Le benzènesulfonamide 30 substitué a été préparé à partir de l’aniline 29 par une réaction de Sandmeyer et un traitement subséquent du chlorure de benzènesulfonyle résultant avec de l’ammoniac. Le couplage croisé de 30 avec 5 a été effectué avec du CuI, de la l-proline et du K3P04 dans du DMSO à 120 ° C pour donner les composés 31 “35. Cependant, en raison de l’ortho-substitution favorable de 30 (R = 2-Cl), une méthode alternative a été développée pour la synthèse de 40. Brièvement, sulfonamide 37 a été préparé à partir de 5-fluoro-2-nitro-phénylamine 36, et il était Ensuite, le groupe nitro de 38 a été réduit par du chlorure d’étain (II) dans des conditions de reflux en benzène-1,4-diamine 39. Une réaction de Sandmeyer sélective de 39 avec du cuivre (II). Le chlorure et le nitrite de tert-butyle ont donné l’analogue 2-chlorure 40 avec un rendement modéré.Schéma 2Synthèse des benzènesulfonamides substitués 31 et 32As attendus, les dérivés 31, 32 et 40 avec une substitution F ou Cl supplémentaire ont montré une # x02013; augmentation de 5 fois de la puissance inhibitrice par rapport au composé parent 28 (tableau 2). D’un autre côté, des groupes de substitution supplémentaires tels que le méthyle, le méthoxyle et le CF3 ont généralement conduit à une réduction des activités antivirales. Il est à noter que 31 et 40 ont montré une sélectivité de plus de 600 fois (CC50 / EC50) contre les cellules MDCK dans le test CPE.Tableau 2 Activités anti-grippales des analogues de sulfonamide et leurs profils DMPKPour confirmer que la nouvelle série cible la protéine HA de la grippe et bloque Comme prévu, l’effet inhibiteur des analogues représentatifs sur l’hémolyse des globules rouges de poulet (GR) a été testé. Comme l’un des composés les plus puissants dans le test CPE, 23 bloqué efficacement l’hémolyse des globules rouges avec une CI50 de 0,06 μ M. En accord avec les résultats de CPE, les analogues 11, 25 et 26 n’ont pas eu d’impact évident sur l’hémolyse avec des valeurs IC50 supérieures à 31,6 μ M. Le sulfonamide 40 présentait une puissante inhibition de l’hémolyse avec une CI50 de 0,25 μ M, mais il n’a pas eu d’effet sur l’hémagglutination, dans laquelle seule la liaison virale HA-récepteur cellulaire est impliquée. Ce résultat suggère que 40 empêche l’hémolyse très probablement en se liant à la région de tige de HA et interférant ainsi avec les changements conformationnels cruciaux de HA normalement déclenchés par un environnement de pH bas. Il a été bien documenté que les changements conformationnels déclenchés bas pH de HA exposer ses sites internes de clivage de la trypsine et rendre HA sensible à la trypsine. Ainsi, le mécanisme d’action de 40 a été davantage vérifié dans un test de sensibilité à la trypsine HA avec 1 comme témoin positif (Figure 2) .2). Le HA purifié, en présence ou en l’absence de composés, a été soumis à un bref traitement à faible pH suivi d’une digestion à la trypsine. Il a été clairement démontré que le 40 protège l’HA contre la dégradation de la trypsine induite par le pH bas (Figure 2,2, ligne 6) .Ainsi, les études du mécanisme d’action et les données CPE indiquent que 40 inhibe la fusion du virus avec membrane hôte endosome en se liant à HA et en empêchant les changements conformationnels de la structure de préfusion HA.Figure 2SDS-PAGE analyse de la sensibilité à la trypsine montrant 1 et 40 HA purifié protégé de la digestion trypsine.Ligne 1, HA purifiée, voie 2, HA traitée avec trypsine sans étape d’acidification préalable, voie 3, HA acidifiée sans traitement trypinique, voie …

un rôle central dans l’équilibre de l’interaction entre la coagulation du sang et

saignement. Toute rupture de plaque athérosclérotique dans l’artère va s’activer

l’agrégation des plaquettes, qui est un composant majeur du sang

caillot.1 Lorsqu’un caillot obstrue un petit vaisseau,

il peut empêcher le sang de circuler vers le coeur et provoquer une crise cardiaque,

qui est une cause majeure de décès dans les pays développés. Des médicaments qui

inhiber l’agrégation plaquettaire peut être utilisé pour traiter les patients ayant une

événements cardiovasculaires et prévenir de futures crises cardiaques. Aspirine et

Les thiénopyridines sont deux classes d’antiplaquettaires couramment prescrites

agents. L’aspirine agit en bloquant l’activation des plaquettes par le thromboxane,

alors que les thiénopyridines agissent en inhibant de façon irréversible le récepteur de l’ADP

P2Y12.2,3 Malgré l’utilisation de ces médicaments,

la crise cardiaque est toujours une cause majeure de mortalité. Il y a un non satisfait

besoin clinique de nouveaux médicaments fonctionnant selon un mécanisme entièrement différent

comparé à l’aspirine et aux thiénopyridines. Nous avons publié

sur l’activité de plusieurs séries d’agents antiplaquettaires, dérivés

à partir du produit naturel himbacine, qui fonctionne par un nouveau mécanisme. 4 − 10 Ces agents sont des antagonistes du récepteur de la thrombine PAR-1 (également

appelé récepteur activé par la protéase, PAR), un récepteur couplé à la protéine G,

situé sur la surface des plaquettes. Bien que deux types de récepteurs PAR

sont présents chez l’homme (PAR-1 et PAR-4), PAR-1 domine la thrombine

activation de plaquettes médiée.11 − 17 thrombine clive le domaine extracellulaire de ces récepteurs exposant

un ligand attaché, qui active ces récepteurs menant à la

agrégation des plaquettes, ce qui conduit finalement à la formation de

thrombi riche en plaquettes. Ces thrombus peuvent souvent occlure la coronaire

artères conduisant à une crise cardiaque. Optimisation de notre himbacine

base de plomb a conduit à la découverte de vorapaxar, un antiplaquettaire de première classe

l’agent antagoniste du récepteur PAR-1.8 Dans un récent essai clinique sur le Ph-III, le vorapaxar a été évalué

contre la prévention secondaire des événements athérothrombotiques.18,19 Vorapaxar a montré une réduction significative de la mortalité cardiovasculaire

événements. Ainsi, la preuve de concept du traitement de l’agrégation plaquettaire

par l’antagonisme du récepteur PAR-1 a été cliniquement validée.Comme la chaîne latérale C7-carbamate de vorapaxar est un

site du métabolisme, 20 dans le cadre de notre activité –

études sur les analogues de vorapaxar nous étions intéressés par des analogues où

le carbamate est cyclisé d’une manière spirocyclique pour donner un analogue

comme 5b (Figure ​ (Figure1) .1). Nous croyions

que cela pourrait concerner le métabolisme du carbamate observé chez le vorapaxar.

Dans cette lettre, nous décrivons la synthèse, l’activité PAR-1 et un docking

modèle de ces nouveaux analogues spirocycliques de vorapaxar.Figure 1Spirocyclic

analogue de vorapaxar.Synthèse des analogues spirocycliques de l’oxazolidinone 5a – d (schéma 1)

commence avec la cétone connue 1,5 qui a été convertie en l’oléfine 8 en utilisant la norme

Condition d’oléfination de Wittig. Hydroboration de cet alcène en utilisant 9-BBN

a donné le composé 3 comme l’isomère majeur, qui a été converti

au carbamate 4 en utilisant l’isocyanate de trichloroacétyle.

La spirocyclisation du carbamate 4 pour donner l’oxazolidinone 5a a été réalisée en utilisant l’insertion de C – H médiée par le rhodium

tel que décrit par Dubois.21 Le 3-fluorophényl

l’analogue 5b a été synthétisé par ozonolyse de 5a donnant l’aldéhyde 6, qui a été couplé avec

phosphonate 7. Pour synthétiser des analogues où le phényle

la substitution est modifiée plus loin, nous avons préparé le pyridyle bromo-substitué

intermédiaire 9 provenant de l’aldéhyde 6 et du phosphonate 8. Ceci a permis la réaction directe de couplage de type Suzuki

sur 9 pour obtenir les cibles désirées 5c – d.Schéma 1Synthèse d’analogues spirocycliques 5a – dLa synthèse de l’oxazolidinone isomère

analogues spirocycliques, où le groupe C7-amino prend la

β -orientation, représenté par les structures 12a – f, est présenté dans le schéma 2. L’alcoolique

la fonctionnalité de 10a a été convertie en carboxamide 11a en utilisant l’isocyanate de trichloroacétyle, ce qui a donné

analogue spirocyclique 12a après rhodium facilité C – H

insertion.21 analogique 12b était

préparé d’une manière similaire à partir de l’alcool 10b. Pour préparer des analogues où la substitution phényle est modifiée, l’intermédiaire 15 a été préparé. Préparation de 15 commence par 10a, où la fonctionnalité alcoolique a été protégée en tant que

acétate et la double liaison a été clivée par ozonolyse pour donner le

aldéhyde 13. Le couplage de cet aldéhyde avec le phosphonate 8 a donné 14, qui a été converti en carbamate 15. Spirocyclisation suivie d’un couplage croisé de l’aryle

bromure avec des acides aryl boroniques substitués de manière appropriée ou aryle

le réactif de zinc a donné les analogues cibles 12c – f.Schéma 2Synthèse d’analogues spirocycliques 12a – fWe

également synthétisé des analogues d’oxazolidinone isomères où l’oxygène

L’atome du cycle oxazolidinone est directement attaché à la position C7 de l’anneau carbocyclique comme représenté par les structures 20a – b (Schéma 3). La réaction de 1 avec du méthylure de diméthylsulfonium donne,

après séparation chromatographique, les époxydes 17a et 17b. Les deux époxydes ont été ouverts avec de l’azoture de sodium pour donner

les azides 18a – b, qui en réduction

avec de la triméthylphosphine suivie d’un traitement avec du triphosgène

les analogues de l’oxazolidinone 20a – b.Scheme 3Synthèse d’analogues spirocycliques 20a – bIn vitro

les activités pour les composés cibles ont été déterminées en utilisant [3H] haTRAP comme radioligand comme décrit précédemment.22 Les récepteurs PAR-1 isolés à partir de plaquettes humaines ont été utilisés.

pour cette étude. Les constantes d’inhibition (Ki) pour les analogues spirocycliques sont présentées dans le tableau 1. Parmi les analogues spirocycliques 5a et d, l’analogue 2-cyanophényle 5c (Ki = 5,1 nM) présente la meilleure activité. Cette tendance continue

dans les analogues d’oxazolidinone isomères 12a et f, où l’analogue 2-cyanophényle 12c (Ki = 8,9 nM) présente une excellente activité. contrairement à

les analogues du vorapaxar, la série spirocyclique semble être sensible

à l’effet de la substitution phényle représentée par la marque marquée

réduction de la puissance de l’analogue 3-cyanophényle 5d (Ki = 267 nM) et de l’analogue pyridyl 12f (Ki = 232 nM). Parmi les deux

analogues spirocycliques 20a et 20b où

l’oxygène de l’anneau d’oxazolidinone est directement attaché au carbone C7, l’isomère β

activité que l’isomère &#x003b1 correspondant 20b. Représentant

des analogues ont également été évalués dans des études pharmacocinétiques chez le rat. Les analogues 5a, 5b et 20a ont été dosés par voie orale

à 10 mg / kg, et ils ont montré de bons niveaux de plasma comme indiqué par leur

AUCs jusqu’au point de temps de 6 h qui a été évalué.Tableau 1Inhibition constante et données pharmacocinétiques pour les composés 5a – d, 12a – f, et 20a – bPour mieux comprendre les protéines

interactions ligand et comprendre le SAR, des modèles de composés complexés

avec PAR1 ont été construits par l’amarrage en utilisant la structure cristalline de vorapaxar

lié à PAR-1.23 Comme dans vorapaxar, le

région tricyclique des composés discutés ici se lie à l’extracellulaire

région de boucle, avec le spirocycle pointant vers une ouverture à la

solvant, tandis que la région biaryl se lie à une poche hydrophobe vers

la région transmembranaire. En tant qu’exemple représentatif, nous avons fourni

un modèle de composé 5c lié au récepteur PAR-1 (figure ​ (figure2) .2). Sur la base du modèle, nous essayons de rationaliser

le SAR observé. En général, le SAR dans les séries 5a – d et 12a – f suit

une tendance similaire. Par exemple, dans chaque série, les substitutions à

les positions 2 avec un nitrile ont la plus grande puissance (5c et 12c). Cela peut être expliqué par la liaison

de la région biaryle de ces composés à une sous-poche impliquant des résidus

Pro236, Leu237, Leu262, Leu263 et Lys240 près du bas du

site de liaison de l’inhibiteur. Substituant 2-CN – Ph en 5c et 12c irait bien à la poche. Cependant, 2-F – Ph

(12e) est légèrement court et n’interagit pas efficacement

avec la protéine. L’augmentation de Ki de

Le 2-pyridyle (12f) peut être attribué en partie à la désolvatation

pénalité d’enterrer un atome polaire dans l’environnement hydrophobe.Figure 2Modèle du composé 5c lié au récepteur PAR-1. L’inhibiteur est représenté

comme le bâton (carbone vert) et la protéine comme dessin animé. Le site de liaison

Les résidus de poche et de sélection sont également représentés.Bien que le substituant 3-CF3 soit toléré en 20a, le composé isomérique 20b montre ∼

augmenter en Ki. Nous attribuons ce décalage Ki à la différence dans le produit chimique stéréo

l’orientation entre ces deux isomères. A partir de la modélisation, le NH dans le spirocycle 5a établit une liaison hydrogène avec le squelette C = O du

protéine; dans le spirocycle 12a – f et 20a, ce NH est remplacé par un groupe CH2, qui

est encore toléré (le NH dans le spirocycle 12a – f et O dans 20a est proche de His336). cependant,

pour 20b, l’atome correspondant est un oxygène, ce qui serait

provoquer un conflit électrostatique avec le C = O de la protéine.En résumé, nous avons synthétisé plusieurs C7-spirocyclique

analogues de vorapaxar, évalué leurs activités PAR-1 et utilisé

la structure de cristal vorapaxar / PAR-1 pour construire un modèle d’amarrage pour

ces analogues. Comparé à la série vorapaxar, le spirocyclique

les analogues semblent être plus sensibles à la substitution phényle. le

Les analogues 2-cyanophényliques 5c et 12c ont montré

excellentes activités in vitro, ce qui pourrait s’expliquer par l’excellente

s’intégrer dans un sous-pôle du domaine trans-membranaire de la protéine. | ​​n | none