Détection du bocavirus humain dans le liquide céphalorachidien d’enfants atteints d’encéphalite

Nous rapportons 4 enfants atteints d’encéphalite associée au bocavirus humain HBoV 1 ou 2 Tous les enfants avaient un poids insuffisant et 2 sont décédés; 1 d’entre eux avait une séquence de nucléotides HBoV2 correspondante isolée de particules de sérum et de type bocavirus dans le liquide céphalorachidien observées en microscopie électronique. Aucun autre pathogène n’a été détecté dans le liquide céphalorachidien de ces patients.

L’encéphalite est une cause importante de morbidité et de mortalité dans le monde. Dans les pays industrialisés d’Europe et d’Amérique, l’incidence annuelle d’encéphalite aiguë est de 73 cas pour 100 000 personnes. Jusqu’à 71% de ces patients souffrent de séquelles durables. % die [1, 2] Une myriade d’agents infectieux est associée à l’encéphalite, comme le virus de l’herpès simplex, fréquent chez l’adulte, et le virus varicelle-zona et l’entérovirus, fréquents chez l’enfant [2] -85% des cas d’encéphalite dans le monde restent inconnus, malgré l’utilisation d’un large éventail de méthodes diagnostiques [3, 4] Ceci indique la présence d’agents inconnus ou pathogènes connus qui infectent normalement d’autres organes mais ne devraient pas provoquer d’encéphalite. est la voie la plus commune que les virus empruntent pour entrer dans le système nerveux central et provoquer une encéphalite, nous avons focalisé notre attention sur le bocavirus humain HBoV, qui est capable de provoquer la virémie [5] et, par conséquent, , a le potentiel de se propager à d’autres parties du corps pour initier une infection Chez les enfants, HBoV1 est prévalent dans les infections respiratoires et entériques Trois autres espèces de bocavirus humaines apparentées, nommées HBoV2-4, ont été trouvées préférentiellement dans les selles; HBoV2 a été associé à une maladie gastro-intestinale [6] Les virus responsables d’encéphalites tels que les entérovirus utilisent le tractus gastro-intestinal comme voie d’infection Nous émettons donc l’hypothèse que HBoV1-4 peut provoquer une encéphalite chez les enfants. de l’HBoV, mais aussi évalué pour d’autres virus diarrhéiques, y compris le rotavirus, le norovirus, l’adénovirus et l’astrovirus, comme causes possibles d’encéphalite

Méthodes

Les patients

L’étude a été menée à l’hôpital de l’Institut de santé maternelle et infantile ICMH situé à Matuail, Dhaka, Bangladesh. L’étude s’est déroulée d’avril 2009 à mars 2010 et a été approuvée par le comité d’éthique de l’ICMH. la période d’étude, et 69 ont donné leur consentement à participer à l’étude Le ratio hommes-femmes était 2:13, et l’âge moyen était de 404 mois, 4-144 mois Les parents ont donné leur consentement pour participer à cette étude L’encéphalite a été définie comme présence de fièvre, de convulsions et d’inconscience, avec ou sans signes d’irritation méningée [7] Des échantillons de liquide céphalo-rachidien et de sérum ont été prélevés chez chaque patient L’état nutritionnel des patients a été déterminé en utilisant les normes de croissance de l’Organisation Mondiale de la Santé.

Enquête de routine sur les laboratoires

Les échantillons de LCR ont été soumis à un examen macroscopique et microscopique et ont été cultivés pour les bactéries. La numération leucocytaire totale et différentielle, le taux de sédimentation des érythrocytes, l’hémoglobine et les taux de CRP de la protéine C réactive ont été déterminés

Détection et identification des agents pathogènes

Les amorces employées et leurs références correspondantes sont détaillées dans le tableau supplémentaire 1. HBoV a été détecté par PCR de contact emboîtée qui ciblait la région VP1 / 2. de HBoV1-4 [6] Les analyses PCR ont été répétées pour confirmer les résultats. Les procédures ont été réalisées séparément dans un environnement propre, et chaque fois qu’un contrôle négatif a été utilisé pendant la PCR pour exclure la contamination

Séquence nucléotidique et analyse phylogénétique

Des séquences nucléotidiques de tous les amplicons ont été obtenues à l’aide d’un kit de séquençage BigDye Terminator v31 Applied Biosystems pour confirmer l’identité des produits de PCR, distinguer les espèces HBoV respectives et effectuer des analyses phylogénétiques. Des analyses phylogénétiques ont été réalisées avec la méthode voisine 5 logiciels

Réponses d’anticorps contre HBoV

Les réponses IgG et IgM des immunoglobulines spécifiques à HBoV1-4 dans les échantillons de sérum et de liquide céphalo-rachidien ont été déterminées par dosage immuno-enzymatique [8]

Observation microscopique électronique

Les échantillons de CSF et de sérum HBoV positifs ont été concentrés par ultracentrifugation de 30% de saccharose. Une partie du concentré a ensuite été appliquée sur une grille de cuivre recouverte de carbone, colorée avec 2% d’acétate d’uranyle, et observée au microscope électronique à transmission.

RÉSULTATS

L’ADN de HBoV a été retrouvé dans le LCR de 4 58% des 69 enfants. Les analyses phylogéniques ont démontré HBoV1 chez 2 enfants et HBoV2 chez les 2 autres, dont 1 était également virémique Figure 1 En outre, le rotavirus a été détecté dans le LCR de 2 Aucun autre pathogène n’a pu être détecté dans ces échantillons. Une identité nucléotidique de 100% pour le gène HBoV2-VP1 / 2 a été trouvée entre les souches détectées dans le liquide céphalorachidien et les sérums d’homologation GenBank correspondants AB666091 et AB666092 du patient. 1 Le tableau 1 montre les profils des patients atteints d’encéphalite associée à l’HBoV, les études de laboratoire disponibles, les traitements et les résultats

009 novembre 2009 novembre 2009 décembre 2009 Sexe; âge, mois Homme; 8 hommes; 60 hommes; 17 homme; 36 Poids, kg statut nutritionnel 6 sévèrement insuffisant 14 sévèrement insuffisant 7 sévèrement insuffisant 83 sévèrement insuffisant Résidence Zone municipale Village Municipal Village Membres de la famille, non 4 4 3 5 Vaccination couverte par PEV Complète Complète Complète Maladie développée après vaccination Non Non Non Non Similaire maladie dans le voisinage Non Non Non Non Contact avec les animaux Non Non Oui vache Non Antécédents de morsure ou d’égratignure avant la maladie Non Non Non Non Symptômes avant la maladie Nez nasal Fièvre Fièvre Fièvre Symptômes de la semaine précédente Non Non Non Non Première consultation Médecin qualifié Traditionnel guérisseur Directement à l’hôpital Médecin du village Délai entre le début de la maladie et l’hospitalisation, heures & lt; 24 & 96 & lt; 24 & lt; 24 Durée de l’hospitalisation, jours 2 4 1 2 Tests CSF Couleur Clair Clair Clair Clair Nombre de globules blancs, cellules / μL 3 2 4 4 PMN,% 0 0 0 0 Lymphocytes,% 100 100 100 100 Protéines, mg / dL 45 45 45 45 Glucose, mg / dL 70 55 60 65 Analyses sanguines a Nombre de globules blancs, cellules / μL 12 000 7730 8800 11 000 PMN,% 62 55 62 58 Lymphocytes,% 40 41 38 38 Eosinophiles,% 2 … … … Monocytes,% … 4 … … Basophiles,% … … … … Hémoglobine, mg / dL … 101 8 … VS, mm / h 57 50 20 20 CRP, mg / dL 205 01 06 23 HBoV ADN détecté CSF HBoV2 HBoV1 HBoV1 HBoV2 Sérum HBoV2 Rien Rien Aucun Anticorps spécifiques du HBoV in serumb IgG et IgM négatif HBoV1, 2 IgG positif, IgM négatif IgG et IgM négatif HBoV1 IgG positif, IgM négatif Traitement donné – Ceftriaxone, acyclovir Ceftriaxone, acyclovir Ceftriaxone Résultat Décès sur demande Décès sur demande Variables Pati ent 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Date de prélèvement de l’échantillon Mars 2009 Novembre 2009 Novembre 2009 Décembre 2009 Sexe; âge, mois Homme; 8 hommes; 60 hommes; 17 homme; 36 Poids, kg statut nutritionnel 6 sévèrement insuffisant 14 sévèrement insuffisant 7 sévèrement insuffisant 83 sévèrement insuffisant Résidence Zone municipale Village Municipal Village Membres de la famille, non 4 4 3 5 Vaccination couverte par PEV Complète Complète Complète Maladie développée après vaccination Non Non Non Non Similaire maladie dans le voisinage Non Non Non Non Contact avec les animaux Non Non Oui vache Non Antécédents de morsure ou d’égratignure avant la maladie Non Non Non Non Symptômes avant la maladie Nez nasal Fièvre Fièvre Fièvre Symptômes de la semaine précédente Non Non Non Non Première consultation Médecin qualifié Traditionnel guérisseur Directement à l’hôpital Médecin du village Délai entre le début de la maladie et l’hospitalisation, heures & lt; 24 & 96 & lt; 24 & lt; 24 Durée de l’hospitalisation, jours 2 4 1 2 Tests CSF Couleur Clair Clair Clair Clair Nombre de globules blancs, cellules / μL 3 2 4 4 PMN,% 0 0 0 0 Lymphocytes,% 100 100 100 100 Protéines, mg / dL 45 45 45 45 Glucose, mg / dL 70 55 60 65 Analyses sanguines a Nombre de globules blancs, cellules / μL 12 000 7730 8800 11 000 PMN,% 62 55 62 58 Lymphocytes,% 40 41 38 38 Eosinophiles,% 2 … … … Monocytes,% … 4 … … Basophiles,% … … … … Hémoglobine, mg / dL … 101 8 … VS, mm / h 57 50 20 20 CRP, mg / dL 205 01 06 23 HBoV ADN détecté CSF HBoV2 HBoV1 HBoV1 HBoV2 Sérum HBoV2 Rien Rien Aucun Anticorps spécifiques du HBoV in serumb IgG et IgM négatif HBoV1, 2 IgG positif, IgM négatif IgG et IgM négatif HBoV1 IgG positif, IgM négatif Traitement donné – Ceftriaxone, acyclovir Ceftriaxone, acyclovir Ceftriaxone Résultat Décès Déclaré sur demande Décès Déclaré sur demande Abréviations: CRP, protéine C-réactive; LCR, liquide céphalo-rachidien; PEV, programme élargi de vaccination; ESR, taux de sédimentation des érythrocytes; HBoV, Bocavirus humain; Ig, immunoglobuline; Les PMN, les leucocytes polymorphonucléaires; WBC, cellule de sang blanc Chez les enfants âgés de 6 mois à 6 ans, l’anémie est définie comme les taux d’hémoglobine <11 g / dL La valeur de référence normale pour la VS est de 20 mm / h; Pour la CRP, des échantillons de CSF de 02 mg / dLbAll étaient négatifs pour les anticorps spécifiques de HBoVVue LargeNone des 4 enfants avec l'ADN de HBoV dans leur CSF avait une réponse IgM sérique spécifique contre HBoV1-4 Patient 2 avait de faibles niveaux sériques d'IgG à la fois pour HBoV1 et HBoV2, alors que le patient 4 avait des IgG faibles seulement pour HBoV1 Aucun des échantillons CSF n'était positif pour les anticorps HBoV Tableau 1Dans l'échantillon CSF du patient 1, des particules hexagonales 20-24 nm suggérant un HBoV ont été observées Figure 2 supplémentaire De telles structures étaient absentes La Figure 1 a démontré que 2 des souches de HBoV identifiées dans le CSF des enfants de notre étude partageaient une identité nucléotidique de 99% et étaient groupées avec des souches de HBoV1 présentant une identité nucléotidique de 98-100%. Les 2 autres souches de HBoV partageait une identité nucléotidique de 97% et regroupait avec des souches de HBoV2a présentant une identité nucléotidique de 97% à 98%. Le tableau 2 supplémentaire montre le caractère clinique et le caractère de laboratoire disponible. caractéristiques des enfants atteints de rotavirus et d'encéphalite à méningite N

DISCUSSION

L’étalon de référence pour le diagnostic de l’encéphalite est l’isolement viral en culture cellulaire, mais cette méthode a été remplacée par la détection d’acides nucléiques spécifiques du LCR ou du cerveau [9] Nous rapportons ici la détection de HBoV1 ou HBoV2 dans le LCR de 4 de 69 enfants atteints d’encéphalite sévère La détection de l’HBoV et l’absence de tout autre pathogène identifiable dans le LCR font que l’HBoV était la cause des symptômes d’encéphalite chez nos patients cancer. Cette possibilité est également confirmée par la visualisation de particules de type HBoV chez les enfants. le CSF par microscopie électronique Dans cette étude, nous avons pu détecter HBoV2 dans le sérum de 1 patient, et la virémie HBoV2 a coïncidé avec l’exposition des symptômes. La virémie avec HBoV1 a été documentée dans les infections respiratoires [5], généralement de courte durée, et est donc considéré comme un excellent marqueur de l’infection primaire aiguë [10] Cependant, la virémie HBoV2 n’a, à notre connaissance, pas été signalée ailleurs. La détection de virémie est compatible avec une courte phase virémique également pour HBoV2 Bien que HBoV soit capable d’induire des réponses significatives chez les enfants atteints de pneumonie [10], les réponses IgM spécifiques de HBoV n’ont pas pu être détectées dans nos échantillons de CSF. Dans la présente étude, une courte période d’hospitalisation a entravé la collecte d’échantillons appariés de sérum et de liquide céphalo-rachidien à des fins d’examen. Tous les patients atteints d’encéphalite à HBV ont une insuffisance pondérale sévère. L’immunosuppression causée par la malnutrition de ces enfants ont contribué à leur manque de réponses sérologiques dans la phase aiguë Les résultats des patients infectés par ces virus n’étaient pas bénins: 2 d’entre eux sont morts Nous ne connaissons pas le sort des 2 autres enfants, car ils ont quitté l’hôpital à la demande de leurs parents pas une pratique rare au Bangladesh, parce que le coût de la vie dans la ville est inabordable pour les gens qui viennent Les résultats des investigations du LCR chez tous les patients positifs pour l’HBoV étaient dans les limites normales, ce qui n’est pas inhabituel pour l’encéphalite virale [4, 11], et cela peut être dû à une réponse inflammatoire altérée associée à leur état de malnutrition Etant donné que la pléocytose était absente chez ces patients, on pourrait considérer qu’ils devraient être classés comme encéphalopathie [12] La tomodensitométrie ou l’imagerie par résonance magnétique est recommandée pour le diagnostic d’encéphalite / encéphalopathie, mais en raison des limites financières. les patients, il n’a pas été possible de poursuivre ces études Des résultats intéressants ont été obtenus pour les taux sériques de CRP, en ce que 3 patients présentaient des taux élevés. En outre, chez les patients avec le plus haut niveau de CRP, HBoV2 était également détecté dans le sérum par PCR. Des particules de type bocavirus ont été observées dans le CSF en microscopie électronique. Les séquences de HBoV2 détectées dans le CSF et le corres Le même sérum était présent dans le LCR, ce qui indique que l’encéphalite à HBoV est causée par la voie hématogène du virus. Le mécanisme par lequel la barrière hémato-encéphalique est perturbée durant l’infection par le HBoV a certainement besoin d’être élucidé. Le séquençage complet des nucléotides de ces HBoV est nécessaire pour déterminer si la dissémination de l’HBoV dans le SNC est liée à l’hôte ou associée à des mutations virales conduisant à un tropisme cellulaire altéré ou à des changements d’expression génique entraînant une pathogenèse virale. En conclusion, nous commençons à comprendre l’importance de HBoV1 et HBoV2 en tant qu’agents pathogènes D’autres études sont nécessaires pour déterminer si HBoV3 et HBoV4 peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et dans quelle mesure les HBoV provoquent une encéphalite ou une encéphalopathie dans d’autres pays Globalement, les bocavirus humains doivent être envisagés dans les cas pédiatriques d’encéphalite

Remarques

Remerciements

Nous remercions Lea Hedman pour effectuer des immunodosages enzymatiques pour HBoV1-4 et Aiko Yasuda pour la microscopie électronique

Aide financière

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention pour la recherche scientifique B de la subvention de la Société japonaise pour la promotion des sciences 20406026, le fonds de recherche à la discrétion du président, subvention de l’Université Oita 610000-N5010 à KA et NA, et les fonds de recherche de l’Académie de Finlande accordent le 1122539 et le MSV de l’Université d’Helsinki

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués