Détection et Identification des Espèces de l’ADN de Leishmania à partir des Impressions des Lésions de Papier Filtre pour les Patients atteints de Leishmaniose Cutanée Américaine

ContexteLa détection traditionnelle de Leishmania à partir d’ulcères implique la collecte de spécimens invasifs provoquant un inconfort, nécessitant une expertise technique et des risques de procédures invasives. Nous avons comparé les méthodes de diagnostic traditionnelles avec une méthode non invasive de papier filtre pour le diagnostic de leishmaniose cutanée dapoxetinefr.com. Une réaction en chaîne de la polymérase a été réalisée sur des prélèvements de lésions, des aspirations et des impressions de papier filtre. L’étalon de référence était l’un des tests positifs: frottis, culture par aspiration, prélèvements et aspira- tions de PCR invasive, PCR sur papier filtre, Leishmania spéciation a été réalisée par polymorphisme de longueur de fragment de restriction PCR RFLP des échantillons positifsResultats -Forty-cinq patients avec des lésions ont été inclus Des lésions diagnostiquées comme leishmaniose cutanée, ont été positifs par PCR des échantillons invasifs versus PCR des papiers filtres P = La sensibilité et la spécificité de la PCR sur les échantillons obtenus de manière invasive étaient%% intervalle de confiance [IC],% -% et%% CI,% -% Sensibilité et spécificité du papier filtre PCR %% IC,% -% et% La culture, le frottis et le test cutané à la leishmanine ont tous des sensibilités inférieures, comparés à la PCR des spécimens invasifs ou non invasifs P & lt; Des échantillons positifs par PCR, avaient suffisamment d’ADN pour l’analyse PCR-RFLPConclusionsFilter paper La PCR constitue une alternative sensible et spécifique aux tests diagnostiques traditionnels Cette nouvelle méthode rapide et bien tolérée peut être largement utilisée sur le terrain et dans les populations pédiatriques traditionnelles. la collecte d’échantillons est la plus difficile à réaliser et peut potentiellement être utilisée pour l’identification rapide des espèces

Le diagnostic définitif de la leishmaniose cutanée CL peut être difficile, en particulier dans les pays à ressources limitées où ces maladies sont principalement endémiques. Le diagnostic standard accepté implique l’isolement des parasites au microscope ou par culture, les deux impliquant l’obtention de spécimens par voie invasive. Les raclures et les aspirations des bases et des bordures de l’ulcère sont les échantillons cliniques les plus couramment obtenus pour le diagnostic de CL, dont la sensibilité va de% -% à l’extrémité inférieure pour la culture à% pour la PCR. -] Ces techniques peuvent causer un inconfort considérable, nécessitent une expertise technique, comportent tous les risques de procédures invasives, y compris saignement et infection, et sont particulièrement difficiles à effectuer dans la population pédiatrique, dans les milieux éloignés, et dans ceux avec bactérienne ou fongique intercurrente superinfection Ainsi, il existe un besoin urgent de proc de diagnostic moins invasif, plus simple et sensible eduresPCR est un outil très sensible pour la détection de l’ADN de Leishmania [, -] Cependant, à ce jour, cette plate-forme a été principalement réalisée en utilisant les spécimens cliniques précités PCR des impressions de lésions sur papier filtre est une approche diagnostique potentiellement non invasive du CLPCR le papier, inoculé avec du sang, un prélèvement de moelle osseuse ou des biopsies cutanées est un outil sensible pour détecter l’ADN de Leishmania. Pour le CL, la PCR du papier filtre inoculé par biopsie a démontré le même taux de positivité que les tests parasitologiques et immunologiques. positif en% des cas confirmés Marques et al recommandent que les échantillons cliniques de patients atteints de CL soient collectés et conservés sur papier filtre pour un test de PCR dans un laboratoire de référence Cette méthode est simple, relativement peu coûteuse , et est adéquat pour les conditions de terrain dans les pays en voie de développement Ainsi, PCR des impressions de papier filtre des bases d’ulcères humides dans Amer ican CL peut offrir une alternative non invasive aux raclages, aux aspirations et aux biopsies dans des cas cliniquement suggestifs.Nous avons comparé plusieurs méthodes «traditionnelles» pour diagnostiquer la CL américaine, y compris la culture et la PCR des lésions et des frottis, les frottis lésés par Giemsa et la peau de leishmanine En outre, nous avons effectué l’identification des espèces en utilisant le polymorphisme de polymorphisme de longueur des fragments de restriction de PCR des échantillons cliniques, ce qui est important dans des pays comme le Pérou où plusieurs membres du complexe Leishmania Viannia peuvent causer des maladies. et présage des pronostics différents

Méthodes

Site d’étude

L’étude a été réalisée à la Clinique Leishmania de l’Institut de Médecine Tropicale “Alexander Von Humboldt” et à l’Hôpital Nacional Cayetano Heredia, à Lima, Pérou, entre janvier et avril, suite à l’approbation du comité d’examen institutionnel. et la prise en charge de la leishmaniose tégumentaire américaine, avec une moyenne de – nouveaux cas diagnostiqués par mois

Population étudiée

Des patients consécutifs se présentant à la clinique Leishmania pour l’évaluation des lésions cutanées ont été contactés pour participer à cette étude, et ont passé en revue les critères d’éligibilité. Nous avons inclus les patients qui ont été référés à la Clinique Leishmania pour suspicion de LLC américaine; avait une indication clinique pour gratter la peau et aspirer; Nous avons exclu les patients présentant des signes cliniques de surinfection bactérienne ou fongique intercurrente de l’ulcère. et ceux qui subissent un traitement actif pour CL

Échantillonnage

Après avoir enlevé toute croûte ou croûte sus-jacente avec de la gaze humidifiée, des feuilles individuelles de papier filtre Fisher Fisher de faible grosseur, stérile et de marque Fisher, ont été délicatement pressées sur la base de l’ulcère humide. les papiers ont ensuite été séchés à l’air et des poinçons ont été obtenus et stockés dans des tubes Eppendorf -mL contenant du μL% d’éthanol pour un test PCR qualitatif. Pour éviter toute contamination entre les échantillons, le poinçon monotrou a été utilisé immergé et lavé dans de l’eau savonneuse pendant min, laissé sécher à l’air, puis nettoyé à nouveau avec des lingettes d’alcool isopropylique séparées

Figure Vue largeTéléchargement de diapositiveCollection de spécimens utilisant la méthode d’impression de lésion du papier-filtre de marque Fisher-A, nettoyage d’un ulcère soupçonné d’être une leishmaniose cutanée avec un antiseptique topique; B, préparation du papier filtre pour la collecte d’échantillons; C, application du papier filtre à la base de l’ulcère; D, évidence d’exsudats de liquide tissulaire et d’ulcère sur le papier-filtreFigure collection largeTélécharger la collection de spécimens en utilisant la méthode d’impression de lésion de papier-filtre de marque Fisher, A, nettoyage d’un ulcère soupçonné d’être une leishmaniose cutanée avec antiseptique topique; B, préparation du papier filtre pour la collecte d’échantillons; C, application du papier filtre à la base de l’ulcère; Après avoir nettoyé avec de l’antiseptique topique, le matériel de lésion a été gratté à partir de la base de l’ulcère et de la bordure à l’aide d’une lancette stérile, et étalé sur une lame de verre. Les lames ont été préparées comme décrit. quantifié comme suit: note = pas d’amastigotes par champ de forte puissance; = – amastigotes par champs de forte puissance; = – amastigotes par champs de forte puissance; = – amastigotes par champs de forte puissance; = – amastigotes par champ de forte puissance; = – amastigotes par champ de forte puissance; = & gt; amastigotes par champ de forte puissance Les lancettes ont été conservées à – ° C dans des tubes Eppendorf -lL contenant du μL% d’éthanol pour un test qualitatif de PCR.Les lésions cutanées ont été aspirées en double comme décrit précédemment Le fluide aspiré a été inoculé en parallèle. : Un μL dans des tubes de culture tissulaire à côtés plats Nalge Nunc International contenant ml de milieu de gélose au sang moyen Novy-MacNeal-Nicolle modifié; Numéro de catalogue DIFCO avec% de sang de lapin défibriné, ou B μL d’un: mélange d’aspirat et% RPMI moyen du Roswell Park Memorial Institute; Invitrogen additionné de L-glutamine,% de sérum fœtal bovin, NaHCO mM, bioptérine mg / ml et pH ajusté à [% microculture RPMI] dans des tubes capillaires stériles, non héparinisés × mm Des tubes capillaires Chase Scientific Glass ont été inoculés et scellés comme décrit ailleurs [ ,] Les cultures ont été marquées et incubées comme décrit précédemment L’échantillon restant a été conservé à – ° C pour des tests de PCR qualitatifs.

LST

Les LST ont été appliqués en utilisant mL de lysat de promastigote interne, stérile et tué par la chaleur dans le% thimérosal comme décrit et lus à h après l’administration. Un résultat positif a été indiqué par ⩾ mm d’érythème et induration comme décrit précédemment [, ,]

Isolement d’ADN kinétoplastidique à partir de papiers-filtres, d’aspirats et de lancettes

Avant l’extraction de l’ADN, on a incubé à la température ambiante des piqûres et des poinçons de papier-filtre congelés à la température ambiante avec un ul de tampon TE Tris-HCl mM, EDTA mM pour éliminer les contaminants. Les échantillons ont été centrifugés à g pendant min et le surnageant a été jeté. les traces ont été retirées des lancettes stockées à l’aide de pointes de micropipette stériles et transférées dans des microcentrifugeuses. L’isolement de l’ADNc de kinétoplastidase a été réalisé avec la méthode au phénol-chloroforme-alcool isoamylique comme décrit précédemment

kDNA PCR

La PCR de l’ADNc a été réalisée en utilisant le kit HotStar Taq DNA Polymerase Qiagen Le volume final du mélange réactionnel était de μL Les conditions de PCR étaient les suivantes: ° C pendant min, suivi de cycles de dénaturation à ° C pendant s; amorce de recuit à ° C pendant s; l’extension à ° C pendant s, et une étape d’extension finale à ° C pour min iCycler iQ; Bio-Rad La première amorce, spécifique de Leishmania sous-genre Viannia, a les séquences suivantes: MP-L fwd ‘-TACTC-CCCGACATGCCTCTG-‘ et MP-H rev ‘-GAACGGGG-TTTCTGTATGC-‘, et génère un produit bp long Les séquences d’amorces de contrôle, qui amplifient une région du gène de l’hémoglobine ß humaine, étaient: HBBL fwd ‘-GGCAGACT-TCTCCTCAGGAGTC-‘ et HBBR rev ‘-CTTAGACCTC-ACCCTGTGGAGC-‘, et ont généré un produit ayant une longueur de pb. Les amplicons ont été visualisés sur% gels d’agarose Promega et colorés au bromure d’éthidium

Identification de l’espèce par PCR-RFLP

Trois tests PCR ciblant différentes séquences spécifiques de Leishmania sous-genre Viannia, dont LV braziliensis, LV peruviana et LV guyanensis, les principales espèces causales au Pérou, ont été utilisés pour l’identification des espèces après PCR kDNA initiale. sélectionné pour PCR et RFLP ultérieures, basé sur la faible probabilité d’identification d’espèces réussies directement à partir d’un échantillon clinique, plutôt que d’une culture. Des tests PCR ont été effectués en utilisant le kit d’ADN polymérase Taq de HotStar. Le premier essai, ciblant le gène Cpb de la cystéine protéinase B, a utilisé des amorces avec les séquences suivantes, qui distinguent l’espèce LV braziliensis et l’espèce non L V braziliensis, et a généré un produit bp long: Cpb fwd ‘-TGTGCTATT CGAGGAGTTCAA-‘ et Cpb rev ‘-TTACCCTCAGGAATCACTTTGT-‘ Les conditions de PCR Cpb étaient les suivantes: ° C pour min, suivi de cycles de dénaturation à ° C pendant s; amorce de recuit à ° C pendant s; l’extension à ° C pendant s, et une étape d’extension finale à ° C pour min iCycler iQ; Bio-Rad Le second test, ciblant la protéine de choc thermique hsp, utilise des amorces avec les séquences suivantes, qui distinguent LV guyanensis et espèces non-L V guyanensis, et génère un produit bp long: hsp fwd ‘-GACGGTGCCTGCCTACTTCAA-‘ et hsp rev ‘-CCGCCCATGCTCTGGTACATC-‘ Les conditions de PCR Hsp étaient les suivantes: ° C pour min, suivi de cycles de dénaturation à ° C pendant s; amorce de recuit à ° C pendant s; l’extension à ° C pendant s, et une étape d’extension finale à ° C pour min iCycler iQ; Bio-Rad Le troisième et dernier test, ciblant le gène mannose phosphate isomérase MPI, a utilisé des amorces spécifiques allèle avec les séquences suivantes, qui distinguent LV braziliensis et LV peruviana, et généré un produit bp long: MPI fwd ‘-GCTCTTCCTGTCGGACAGCGAGC – ‘commune aux deux espèces et MPI rev’ -GTCGGCAGCGTCACGGAGGTCG- ‘[spécifique de LV braziliensis] et MPI rev’ -GTCGGCAGCGTCACGGAGGTCC- ‘[spécifique de LV peruviana] Les conditions de PCR MPI étaient les suivantes: ° C pour min, suivi de cycles de dénaturation à ° C pendant s; amorce de recuit à ° C pendant s; l’extension à ° C pendant s, et une étape d’extension finale à ° C pour min iCycler iQ; Bio-Rad Tous les produits de PCR ont été visualisés sur% de gels d’agarose Promega et colorés au bromure d’éthidium

Analyse RFLP des produits de PCR Cpb et Hsp PCR-RFLP

Après amplification PCR Cpb et Hsp comme ci-dessus, les produits ont été digérés séparément pendant une nuit à ° C pour le test cpb, ou ° C pour le test hsp, dans un volume total de μL, avec U de chaque enzyme de restriction. réaction: Cpb TaqI et hsp HaeIII fermentas réactions ont été arrêtés avec protéinase K mg / ml produits RFLP ont ensuite été analysés séparément en utilisant% électrophorèse sur gel de Polyacrylamide MiniProtean III; Bio-Rad, et coloré avec la coloration à l’argent Promega MPI PCR a été utilisé pour confirmer l’identité de LV peruviana dans les cas où le motif de fragment de restriction cpb était non-L V braziliensis, et le modèle de fragment de restriction hsp était non-L V guyanensis, et a également servi de contrôle interne du test cpb

Norme de référence composite

Nous avons défini une lésion comme CL lorsque l’un des tests était positif, où les tests se référaient à LST, frottis de lésion, culture, PCR d’aspira- tions et raclages, ou PCR de papier filtre. Ces tests servaient de référence composite pour chaque test diagnostique individuel. par rapport

Calcul de la taille

Sur la base de la littérature existante [, ,,], nous avons estimé la sensibilité globale des méthodes moléculaires invasives à% et la sensibilité de la microculture la méthode invasive non moléculaire la plus sensible à% Pour obtenir une sensibilité des lésions du papier filtre Pour l’analyse de sensibilité, l’étalon de référence composite susmentionné a été appliqué, et l’unité d’analyse était la lésion. Les lésions ont été supposées non corrélées chez les patients. comme décrit précédemment ailleurs,

analyses statistiques

Les statistiques descriptives signifient, écart-type, médiane, fourchette ont été calculés pour les variables continues, et les différences ont été comparées à l’aide du test t -total. Les variables catégorielles ont été quantifiées par proportions, et les différences entre les groupes ont été comparées. comparé en utilisant le test z Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant SigmaStat, version SPSS Le niveau de signification a été fixé à P & lt;

Résultats

Quarante-cinq patients présentant des lésions cutanées ont été inclus dans l’étude: hommes et femmes L’âge médian était de plusieurs années, et la durée médiane d’exposition dans la zone à risque était de plusieurs mois, jour-années Travail dans l’agriculture et résidence ou tourisme dans un région endémique étaient les principales professions à risque%,% et%, respectivement Les étudiants représentaient seulement% de la cohorte La durée médiane des lésions était de mois, mois- années Vingt-deux patients% présentant des lésions multiples, avec un nombre médian de lésions par patient de gamme, – lésions par patient Deux des participants de l’étude% présentaient une atteinte intercurrente de la muqueuse et cutanée La majorité des lésions cutanées étaient purement ulcératives%, avec un nombre beaucoup plus faible de lésions ayant une présentation principalement nodulaire ou verruqueuse% et% , respectivement Les lésions étaient principalement localisées à l’extrémité supérieure%, face% ou extrémité inférieure% Utilisation de l’étalon composite au moins / tests positifs, lésions% fu Critères remplis pour un diagnostic de CL Cinquante-huit lésions% étaient positives pour au moins un test,% positives pour au moins un test,% positives pour un ou plusieurs tests, et% positives pour tous les tests. l’unité d’analyse, les sensibilités et les spécificités des dosages individuels n’ont pas sensiblement changé par rapport à l’analyse des perlesion

Culture

Des lésions qui étaient positifs au moins des tests de diagnostic, étaient positifs à la culture La sensibilité et la spécificité de la culture a été%% intervalle de confiance [IC],% -%] et%, respectivement le tableau Culture avait une sensibilité supérieure seulement à LST P =

Tableau Analyse des tests diagnostiques utilisés dans l’évaluation des lésions soupçonnées d’être leishmaniose cutanée Essai Nombre de lésions testées positives Nombre de lésions testées négatives Sensibilité,% Spécificité,% PPV,% NPV,% LSTa Smear kDNA PCR des spécimens invasifsb kDNA PCR Essai de culture Nombre de lésions testées positives Nombre de lésions testées négatives Sensibilité,% Spécificité,% PPV,% NPV,% LSTa Smear kDNA PCR de spécimens invasifsb kDNA PCR de spécimens non invasifsc Culture NOTE kDNA, Kinetoplastid DNA; LST, test cutané à la leishmanine; NPV, valeur prédictive négative; PCR, amplification en chaîne par polymérase; VPP, valeur prédictive positive Un individu n’a pas subi de test cutané à la leishmaninebInclut les lésions d’aspiration et de raclagecInclut les impressions de lésions sur papier filtreVue grand

Des frottis

Trente et une lésions étaient positives au frottis coloré au Giemsa, ce qui donne une sensibilité de% IC%,% -% Tableau Dans les lésions qui présentaient un frottis positif, la densité médiane de l’amastigote était un grade – amasti-gotes / champs de forte puissance. qui répondaient aux critères diagnostiques standard de référence composite, la densité médiane des frottis était plus élevée chez ceux qui étaient également de catégorie de densité positive de culture [- amastigotes / champs de forte puissance] comparés à ceux qui étaient de catégorie de densité de culture négative P & lt;

PCR des raclures et des aspirations

Cinquante lésions étaient positives par PCR des spécimens obtenus de manière invasive, donnant une sensibilité de%% CI,% -% Tableau Cependant, seules celles positives par PCR remplissaient les critères diagnostiques standard de référence, donc dans la lésion, la PCR des spécimens invasifs était la seule test Comparé à l’étalon composite de référence, la spécificité de la PCR des échantillons invasifs était de% IC%,% -% Le tableau PCR des échantillons invasifs était plus sensible que le LST P & lt; , frottis P & lt; et culture P =

PCR des impressions de papier filtre

Quarante-huit lésions étaient positives par PCR d’impressions de lésion de papier filtre, donnant une sensibilité et une spécificité de%% IC,% – %% et%, respectivement. PCR des impressions de lésion sur papier filtre était plus sensible que LST P & lt; , frottis P & lt; , et culture P = PCR des impressions de lésion sur papier filtre était aussi sensible que la PCR des spécimens invasifs P =

RFLP

Parmi les lésions avec des échantillons cliniques PCR-positifs, suffisamment d’ADN amplifiable pour spéciation par RFLP était présent dans des ensembles d’aspirats, raclures, et impressions de papier filtre Des papiers filtres kDNA-positifs, aspirats et lancettes avec des résultats RFLP définitifs, identification des espèces comme suit: LV braziliensis, lésion; L V peruviana, lésions; L V guyanensis, lésions; et L V braziliensis-peruviana hybride, tableau des lésions

Identification des espèces d’ensembles de spécimens de réaction en chaîne de la polymérase Lésions positives pour la PCR testées par polymorphisme de longueur de fragment de restriction de PCR RFLP ciblant la cystéine protéinase B, la protéine de choc thermique et les gènes de mannose phosphate Isomérase Aucune% des espèces testées L Viannia braianiensis L Viannia guyanensis L Viannia peruviana Hybride L Viannia braziliensis-peruviana Non identifiable Non testé Espèces de Leishmania Non% de ceux testés L Viannia braziliensis L Viannia guyanensis L Viannia peruviana Hybride L Viannia braziliensis-péruviana Non identifiable Non testéa aExemples avec suffisamment d’ADN amplifiable la PCR de l’ADN kine-toplastid des lancettes, des aspirats et des empreintes de papier filtre a été sélectionnée pour l’échantillon clinique direct PCR-RFLPView Large

LST

Trente-trois lésions provenaient de patients avec des résultats LST positifs, ce qui donne une sensibilité et une spécificité de%% IC,% -% et%% CI,% -%, respectivement.

Discussion

Nous avons démontré dans une évaluation clinique des lésions ulcéreuses suspectes pour la CL américaine au Pérou que la PCR kDNA des impressions de lésion de papier filtre offre au moins une sensibilité et une spécificité diagnostiques comparables à celles des échantillons obtenus de façon invasive tels que les prélèvements lésionnels. manière de LST, de frottis et de culture Bien que les caractéristiques de performance de la PCR sur chaque spécimen soient comparables, les impressions de lésions sur papier filtre sont non invasives, faciles à réaliser et bien tolérées par les patients. Les impressions sur papier filtre peuvent théoriquement être obtenues dans le cadre d’une surinfection bactérienne ou fongique, contrairement aux raclures ou aux aspirations, où l’incision d’un ulcère surinfecté serait contre-indiquée. Ainsi, la population de patients chez qui cette manœuvre diagnostique peut être réalisée peut être plus large que aspires Cependant, il faut reconnaître Ceci est seulement un avantage théorique pour filtrer le papier PCR et n’a pas été évalué dans cette étude. Une évaluation future des caractéristiques de performance du papier filtre PCR dans le cadre de la surinfection est justifiée. Nous avons également démontré que l’identification des espèces peut être directement Bien que seules les lancettes, les aspirats et les papiers-filtres kDNA-positifs aient produit une bande suffisante pour procéder à un RFLP direct des échantillons, l’identification des espèces dans / de ces spécimens constitue une avancée majeure dans notre approche de la spéciation. Promastigotes cultivés et analyse d’isozyme à forte intensité de main-d’œuvre Des études futures visant à optimiser les performances de PCR-RFLP des impressions de lésions sur papier-filtre sont justifiées.Le test diagnostique non invasif en CL est une approche relativement nouvelle, avec une pénurie d’études publiées. D’autre part, la PCR des papiers filtres inoculés avec des Il a été montré que des échantillons cliniques éprouvés comme le sang, les ponctions spléniques et les biopsies cutanées sont un moyen sensible de diagnostiquer la leishmaniose. En appliquant l’approche diagnostique non invasive à la collecte de spécimens à base de papier filtre, nous avons pu contourner l’étape intermédiaire En faisant cela, nous avons réduit les risques inhérents au patient tels que les saignements et les infections, diminué le coût des tests en évitant le besoin d’anesthésie, d’aiguilles, de seringues et d’élimination des déchets dangereux, qui dépassent le coût des papiers filtres et ont fourni aux cliniciens une alternative pratique et peu sophistiquée à l’aspiration et au raclage hautement dépendants de l’opérateur. En raison de sa simplicité, de sa portabilité et de sa tolérabilité, cette méthode pourrait être largement déployée dans les régions endémiques éloignées. qui transporte les papiers-filtres vers un plus grand laboratoire ou centre de référence. Actuellement, beaucoup de régions éloignées n’offrent que des milieux très insensibles. frottis lésionnel, si un bilan diagnostique est effectué Certainement, dans des centres mieux dotés en ressources, les impressions de lésions sur papier filtre devraient être considérées comme supérieures aux tests traditionnels tels que frottis de lésions, culture et LST et au moins comparables aux tests moléculaires des échantillons invasifs Les efforts visant à promouvoir cette méthode non invasive sensible dans les milieux où les capacités de diagnostic sont limitées, ainsi que dans des centres de référence disposant de ressources suffisantes, devraient être poursuivis.

Remerciements

Nous remercions Dr Eduardo Gotuzzo, Ana Luz Quispe, et Carmen Medina de l’Institut de Médecine Tropicale “Alexander von Humboldt” pour le soutien logistique. Soutien financier AKB a bénéficié d’une subvention de développement professionnel du Collège Royal des Médecins et Chirurgiens du Canada pendant la période d’étude