Fusariose associée à la colonisation des espèces de Fusarium pathogènes d’un système d’eau hospitalier: un nouveau paradigme pour l’épidémiologie des infections opportunistes des moisissures

Nous avons cherché le réservoir d’espèces de Fusarium dans un hôpital avec des cas d’infections fusariennes connues. Des cultures d’échantillons de patients et de l’environnement ont été effectuées et évaluées par rapport à des méthodes moléculaires. le% a donné Fusarium solani; % Fusarium oxysporum Fusarium solani a été isolé du réservoir d’eau de l’hôpital Aérosolisation des espèces Fusarium a été documentée après avoir couru les douches Biotypage moléculaire a révélé plusieurs génotypes distincts parmi les isolats de l’environnement et les patients Huit des patients avec Les infections à F solani avaient des isolats avec une correspondance moléculaire avec soit un isolat environnemental n = soit un autre isolat de patient n = L’intervalle de temps entre les paires d’isolats patient-environnement appariés était et mois, et, et années pour les paires isolées patient-patient système de distribution d’eau d’un hôpital a été identifié comme un réservoir d’espèces de Fusarium

Les champignons opportunistes sont une cause de plus en plus importante d’infections nosocomiales; ils ont tendance à être résistants aux agents antifongiques et sont associés à de mauvais résultats Les réservoirs de ces champignons dans le milieu hospitalier sont mal connus. Cependant, l’identification de tels réservoirs permettrait des mesures plus efficaces de contrôle des infections. le réservoir d’espèces de Fusarium, un représentant des champignons opportunistes, dans un important centre d’oncologie avec une incidence significative de patients avec des infections fusariennes et pour évaluer la relation moléculaire des isolats de sources environnementales et de patients Nous avons émis l’hypothèse que le système de distribution d’eau hospitalière sur la base des preuves croissantes de telles eaux contaminées dans le monde , la reconnaissance que les organismes d’origine hydrique peuvent causer de graves infections nosocomiales, et la récupération des espèces de Fusarium dans plusieurs systèmes d’eau non médicaux . une enquête documentant que le système d’eau de l’hôpital peut être la source de la fusariose nosocomiale

Matériaux et méthodes

Méthodes d’analyse Les données sur les niveaux résiduels de chlore libre ont été établies à partir des dossiers d’entretien des établissements, indiquant que les réservoirs d’eau froide maintenaient une concentration moyenne de parties par million de ppm et que les réservoirs d’eau chaude mesuré au moment de la collecte des échantillons L’eau des cuves d’eau froide avait une température moyenne de ° C, et celle des cuves d’eau chaude une température moyenne de ° COrganisme échantillons Des isolats environnementaux et cliniques codés en nombre de Fusarium solani et Fusaroum oxysporum étaient On a remis en suspension une petite partie de l’échantillon lyophilisé dans du sérum physiologique plus Tween% et inoculé sur des tubes de texte inclinés contenant de l’agar dextrose de pomme de terre. On a récolté, filtré et granulé les pellets. , et stockés à ° d’extraction d’ADNc Des flacons contenant un ml de bouillon de dextrose Sabouraud ont été inoculés avec Les cellules ont été récoltées et les sphéroplastes préparés comme décrit ailleurs L’ADN a été extrait des sphéroplastes – poids humide mg à l’aide du Qiagen DNeasy Plant Mini Kit pour l’extraction de l’ADN fragment QiagenRestriction RFLP Pour le RFLP, sur la base du rendement en ADN visualisé sur un gel d’agarose%, des digestions de restriction ont été réalisées, selon les instructions du fabricant, avec des unités d’enzyme de restriction HaeIII Boehringer Mannheim Les échantillons ont été incubés à ° C pendant une nuit. Pour le RAPD, l’amorce oligonucléotidique utilisée pour l’amplification était RP, les données de séquence «-CGG TCA CGC T-» fournies par S Weir, communication personnelle. de la réaction de PCR étaient similaires à ceux utilisés par d’autres Toutes les amorces oligonucléotidiques ont été synthétisées dans le laboratoire du National Cancer Institute Bethesda, Marylan Pour l’utilisation d’un synthétiseur d’ADN / ARN Applied Biosystems Réaction en chaîne par polymérase d’intrépide IR-PCR Pour IR-PCR, une paire d’amorces oligonucléotidiques, AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G et ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C, a été utilisée, et un seul oligonucléotide, TAC ATT TCG AGG ACC CCT AAG TG, a été utilisé comme amorce dans une réaction séparée Des réactions d’amplification ont été réalisées dans des ul de solution de ce qui suit: chlorure de magnésium mM, chlorure de potassium mM, mM ris-hydrocloride, % w / v de gélatine, mM de chaque désoxynucléotide, unités Taq ADN polymérase Boehringer Mannheim, μL d’ADN génomique dilué: dans Tris-EDTA PCR a été réalisée comme suit: ° C pour min, ° C pour min, ° C pour min pour cycles , précédée d’une incubation -min à ° C et suivie d’une -min période d’extension à ° C, se terminant par un trempage en ° C. La totalité de la réaction a été effectuée sur un gel d’agarose% Tris-acétate / EDTA. par la visualisation des images capturées par l’Alphalmager Alpha Innotech Les gels ont été comparés par des chercheurs qui étaient aveugles à l’identité clinique ou environnementale des isolats. Les profils de bandes comparatifs révélés par RAPD, RFLP, et IR- ont été comparés à ceux de tous les autres isolats cliniques et environnementaux. La PCR a été évaluée indépendamment à l’Institut National du Cancer Bethesda, MD Sur la base des profils de gel, la probabilité d’isoler les isolats a été évaluée pour les profils révélés par chacune des méthodes Si les profils de bandes des isolats étaient les mêmes que ceux révélés par la méthode , la relation entre les isolats a été jugée hautement probable Si les profils étaient les mêmes avec la présence ou l’absence de bande, la relation a été jugée probable. Pour fournir une base rigoureuse pour désigner la parenté des isolats, nous avons exigé que la preuve révélé indépendamment par toutes les méthodes RAPD, RFLP et IR-PCR En outre, une quatrième biotie moléculaire procédure de ping, RAPD avec un ensemble différent d’amorces , P GAC AGA CAG ACA GAC A et P GAG GGT GGC GGT TCT, a été réalisée dans une autre étude en laboratoire à l’Université du Texas à Houston Ces résultats ont été utilisés pour évaluer plus parenté Après la comparaison de toutes les souches à l’aide des méthodes de biotypage, les résultats ont été classés. Deux isolats ont été considérés comme apparentés si les profils de bandes révélés par toutes les méthodes ont été notés comme hautement probables. Les isolats ont été considérés comme probablement apparentés Les isolats ont été considérés comme pouvant être apparentés si le profil de baguage pour la méthode a été noté comme étant hautement probable et les profils de baguage pour les autres méthodes ont été notés comme probables. considéré comme non lié si aucun des critères ci-dessus n’a été rempli L’utilisation combinée de toutes les méthodes moléculaires a une sensibilité pour distinguer ≥% d’isolats de F solani

Résultats

Cultures environnementales Les résultats de l’analyse des échantillons d’eau et des échantillons du système de distribution d’eau sont résumés dans le tableau des échantillons du système de distribution d’eau analysés avec le protocole de centrifugation,% étaient positifs pour les espèces Fusarium, Fusarium solani et Fusarium oxysporum En outre, les espèces d’Aspergillus Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Curvularia et Alternaria ont été récupérées dans les réservoirs d’eau chaude des hôpitaux. Des cultures de filtres à eau extraites d’un stérilisateur chirurgical ont produit Fusarium sporotrichioides, ainsi que F solani, F oxysporum. , Espèces d’Aspergillus et Pseudallescheria boydii

Diapositives de l’analyse microbiologique pour la détection d’espèces de Fusarium dans des échantillons environnementaux d’un hôpital de Houston, TexasTable AgrandirDisque de téléchargementRésultats d’analyses microbiologiques pour la détection d’espèces de Fusarium dans des échantillons environnementaux d’un hôpital de Houston, TexasBioaérosol étudie l’aérosolisation des espèces Fusarium et Aspergillus l’espèce a été démontrée dans le mode d’échantillonnage humide; Toutes les cultures en mode sec étaient négatives Sept% des échantillons obtenus par le mode d’échantillonnage par voie humide étaient positifs pour l’air. F oxysporum analyse moléculaire de l’épidémiologie Trente-sept isolats de F solani ont été testés chez des patients consécutifs pour lesquels des isolats étaient disponibles. Lorsque les échantillons ont été analysés à l’aide de RAPD seul, les isolats des patients présentaient une correspondance hautement probable, soit des profils de bandes identiques avec des isolats environnementaux et des correspondances probables, différant de ± bande lorsque les échantillons étaient analysés par toutes les méthodes RAPD, RFLP et l’IR-PCR dans les laboratoires, les études d’épidémiologie moléculaire ont encore révélé que, pour F solani, les combinaisons d’isolats appariés étaient probablement ou possiblement apparentées selon le critère que les isolats correspondent si les résultats de toutes les méthodes de biotypage moléculaire correspondent, ces paires génétiquement apparentées de F solani inclus des corrélations pour les paires isolées patient-environnement et corrélation s pour des paires d’isolats de patients Un troisième couple patient-environnement était apparenté selon les résultats des méthodes, mais celui-ci n’a pas été classé comme un appariement parce que la quatrième méthode n’a pas révélé de bandes similaires. les critères de rigueur élevéeTable résume les résultats selon des critères de rigueur élevés pour la parenté des souches de F solani récupérées des patients et de l’environnement hospitalier. Au total, les patients avec F infections solani avaient des isolats avec une correspondance moléculaire soit avec un isolat environnemental ou un autre isolat de patient, même avec l’utilisation du critère de rigueur élevé des résultats d’appariement de plusieurs méthodes épidémiologiques moléculaires. Les profils de RFLP représentatifs pour les isolats apparentés sont présentés dans la figure

Tableau View largeTélécharger des profils de biotypage moléculaire de souches apparentées de Fusarium solani isolées à partir d’échantillons patients et environnementaux d’un hôpital à Houston, TexasTable View largeTélécharger les diapositives Profils de biotypage moléculaire de souches apparentées de Fusarium solani isolées d’échantillons patients et environnementaux d’un hôpital à Houston, Texas

Figure Vue largeTélécharger Diapositive épidémiologie moléculaire de la fusariose nosocomiale, montrant des corrélations dans les patrons d’ADN génomique des isolats d’espèces de Fusarium isolés dans un hôpital de Houston au Texas, révélée par l’analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction L’ADN a été digéré par HaeIII. gel Voie non marquée, marqueur; voie, ADN provenant d’un isolat de laboratoire témoin Fusarium; voies étiquetées, isolats provenant de patients et de sources environnementales; les nombres indiquent les numéros de laboratoire des isolats. L’isolat environnemental provenait d’un puits; L’épidémiologie moléculaire de la fusariose nosocomiale, montrant des corrélations dans les patrons d’ADN génomique pour des isolats d’espèces de Fusarium isolés dans un hôpital de Houston, au Texas, révélée par l’utilisation de l’analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction. L’ADN a été digéré par HaeIII. et courir sur un gel d’agarose% Marqueur non marqué, marqueur; voie, ADN provenant d’un isolat de laboratoire témoin Fusarium; voies étiquetées, isolats provenant de patients et de sources environnementales; les nombres indiquent les numéros de laboratoire des isolats. L’isolat environnemental provenait d’un puits; Les caractéristiques et les résultats de tous les cas de fusariose invasive chez des patients immunodéprimés atteints de tumeurs malignes hématologiques traitées au même centre de cancérologie ont été signalés ailleurs . L’étude a été menée en examinant les dossiers médicaux des patients positifs. Les infections des organes invasifs ont été documentées à la fois par la culture d’échantillons de l’organe impliqué et par l’examen histopathologique de l’organe. L’infection disséminée a été définie comme l’implication d’au moins des organes non contigus par les espèces de Fusarium. des patients ont été identifiés Les facteurs de risque de fusariose comprenaient les patients sous-jacents récidivants, les patients neutropéniques, les leucémies myéloïdes aiguës et les leucémies aiguës; patients, traitement par corticostéroïdes surrénaux et greffe de moelle osseuse ou de cellules souches BMT; les patients; greffe allogénique dans l’infection Fusarial développé après la médiane de la prise de greffe, des mois après chez les receveurs allogéniques BMT, et de ces patients avaient grade ≥ greffon contre la maladie de l’hôte GVHD Vingt-neuf de ces patients sont morts avec une infection fusarienne disséminée incluant pour qui un examen d’autopsie a été Huit de ces patients avec des infections F solani avaient une correspondance moléculaire, soit entre le patient et l’environnement isoler paires de patients ou entre patients isoler paires de patients L’intervalle de temps entre les paires isolées patient-environnement était et mois Cet intervalle de temps Les patients avaient des isolats correspondant à des souches isolées de sources environnementales liées à l’eau. Patiente, une femme d’un an, atteinte d’AML et recevant des cycles de chimiothérapie d’induction de rémission de la fludarabine, de la cytarabine et de l’idarubicine; Après le second cycle de chimiothérapie, une fièvre neutropénique, de multiples lésions cutanées nodulaires et une détresse respiratoire nécessitant une intubation se sont développées. Une biopsie des lésions cutanées a révélé des hyphes ramifiés cloisonnés et a produit F solani Malgré un traitement de soutien optimal, antifongique Le patient, homme âgé de un an, avait une leucémie myéloïde chronique et a subi une greffe de cellules souches allogéniques avec une greffe réussie. Son parcours hospitalier était compliqué par de la fièvre et de multiples lésions cutanées; Malgré un traitement antifongique approprié, le patient est décédé à la suite d’une infection fusarienne disséminée. Un troisième couple patient-environnement d’isolats de F oxysporum était apparenté à toutes les méthodes effectuées au laboratoire A, mais n’a pas été classé comme un appariement parce que la quatrième méthode réalisée au laboratoire B n’a pas révélé de bandes similaires pour les patients avec des paires d’isolées patient-patient appariées, F solani a été récupéré à partir de l’extrémité d’un cathéter veineux central; Les infections fusariennes ont été diagnostiquées à plusieurs années d’intervalle chez les patients avec des paires d’isolats patient-patient appariés, et des années, ce qui suggère que la même souche de F solani peut avoir persisté dans le système hydrique hospitalier pendant une longue période. période de temps

Discussion

système d’eau hospitalier à Houston, malgré une chloration d’eau standard et adéquate, ppm de chlore est mieux expliqué par la résistance de haut niveau bien connue de diverses moisissures aux niveaux de chlore de l’eau recommandés par l’Environmental Protection Agency des États-Unis. Les espèces de Fusarium à proximité de l’eau courante, associées à l’importance de l’infection sinopulmonaire dans la fusariose, suggèrent que l’aérosolisation des sources d’eau pourrait être en partie responsable de ces infections. La cellulite fusarienne nosocomiale des membres inférieurs pourrait résulter de l’exposition des patients aux espèces Fusarium. la douche, par des ruptures de l’intégrité de la peau La relation moléculaire entre les isolats de F solani a été soumise à une analyse qui a nécessité un accord entre les résultats des méthodes d’analyse moléculaire; Les résultats d’un laboratoire indépendant ayant utilisé une autre technique moléculaire ont corroboré cette découverte. A notre connaissance, une telle approche – l’utilisation d’une combinaison de systèmes moléculaires dans les laboratoires – n’a pas été utilisée dans l’analyse épidémiologique moléculaire des infections nosocomiales. utilisé au laboratoire A a également révélé une troisième paire d’isolats patient-environnement appariés et une autre paire d’isolats patient-patient appariéePas de méthode de biotypage moléculaire unique peut être désignée comme «standard» pour l’identification des espèces Fusarium Nos critères rigoureux ont sans aucun doute empêché certains isolats Cependant, nous reconnaissons qu’aucune méthode ou combinaison de méthodes n’est capable de distinguer tous les isolats dans toutes les circonstances. En fin de compte, les méthodes avancées sont considérées comme plus fiables que celles qui ont été utilisées. et une compréhension des génomes entiers des espèces Fusarium et d’autres champignons filamenteux permettra une discrimination plus fine sur la base d’analyses séquentielles individuelles Reconnaissant pleinement que le biotypage moléculaire est basé sur des technologies en évolution, nous prévoyons que des méthodes plus raffinées seront disponibles à l’avenir. peut expliquer pourquoi les isolats de certains patients ne sont pas apparentés aux isolats environnementaux. Les isolats peuvent avoir eu différents moments d’influx dans le système hydrique Certains patients peuvent avoir été colonisés par des organismes extérieurs au système hospitalier. suggère qu’une infection acquise dans la communauté est théoriquement possible. Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre l’épidémiologie de la fusariose nosocomiale. Ces études devraient être menées prospectivement dans plusieurs centres de cancérologie où des patients gravement immunodéprimés, par exemple ayant subi un BMT allogénique Les études devraient mettre l’accent sur une corrélation entre la présence et la concentration des espèces de Fusarium dans chaque système d’eau hospitalier et l’incidence de la fusariose. Ces études devraient également tenir compte des variations importantes des pratiques entre les centres qui peuvent présenter un risque différent de fusariose. Ces variations incluent des différences dans la sélection des patients subissant une BMT allogénique plus jeunes, plus sains et non traités que des patients plus âgés avec des comorbidités et un traitement antérieur extensif, différents degrés d’immunosuppression, par exemple des cellules souches manipulées vs non maniées, une chimiothérapie myéloablative vs nonmyéloablative La persistance des espèces de Fusarium dans le système hydrique hospitalier sur une longue période de temps est suggérée par la présence d’organismes similaires, tels que déterminés par les méthodes moléculaires utilisées dans les paires isolées patient-patient sur une période de,, et ans Ceci est similaire à ce qui est obse avec des légionelles, un autre agent pathogène d’origine hydrique responsable de la légionellose En effet, les espèces de Legionella ont persisté dans le système hydrique hospitalier pendant des années Sur la base de ces résultats, nous recommandons aux hôpitaux où surviennent des fusarioses devraient envisager de tester leur approvisionnement en eau pour la présence de moisissures opportunistes. Si ces champignons sont récupérés du système d’eau, ces hôpitaux devraient alors formuler des politiques pour éviter ou minimiser l’exposition des patients immunodéprimés à l’eau courante de n’importe quelle source. peut être appliqué dans le monde entier est la prévention de l’exposition des patients immunodéprimés à l’eau du robinet en fournissant de l’eau bouillie stérile pour la consommation d’eau. En outre, les patients doivent éviter de se doucher pendant l’immunosuppression sévère. bains de lit fournis avec jetable stérile En guise de conclusion, nous avons identifié les systèmes de distribution d’eau des hôpitaux et des résidences comme des réservoirs intérieurs potentiels d’espèces de Fusarium.

Remerciements

Nous remercions Edwin E Geldreich, microbiologiste de recherche principal à l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, Drinking Water Research Division, et Glen Mayhall, de la branche médicale de l’Université du Texas à Galveston, au Texas, pour leurs conseils avisés; et Jean Juba, du Centre de recherche sur le fusarium, pour des travaux techniques spécialisés sur la maintenance des isolats de Fusarium et l’identification des espèces de Fusarium