La fidaxomicine est un inhibiteur de l’initiation de la synthèse de l’ARN bactérien

Fidaxomicine a été récemment approuvé pour le traitement de Clostridium difficile. Elle inhibe la transcription par l’ARN polymérase bactérienne Parce que la transcription est un processus en plusieurs étapes, des expériences ont été menées dans lesquelles la fidaxomicine a été ajoutée à différents stades de l’initiation de la transcription. pour élucider le stade inhibé l’initiation des blocs de Fidaxomicine seulement si ajouté avant la formation du “complexe promoteur ouvert”, dans lequel les brins d’ADN matrice se sont séparés, mais la synthèse de l’ARN n’a pas encore commencé La liaison de la fidaxomicine exclut la séparation initiale des brins d’ADN. pré-requis à la synthèse de l’ARN Ces études montrent qu’il possède un mécanisme distinct de celui des inhibiteurs d’élongation, tels que la streptolydigine, et des inhibiteurs de l’initiation de la transcription, la myxopyronine et les rifamycines.

Fidaxomicin FDX a été récemment approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour le traitement de l’infection Clostridium difficile FDX est structurellement similaire aux composés de la lipiarmycine LPR, un mélange de fermentation, qui a été montré pour inhiber une variété d’ARN polymérases RNAP [ -] La RNAP bactérienne est une cible attractive pour les antibiotiques Premièrement, RNAP est l’enzyme centrale de l’expression génique et donc essentielle pour la viabilité. Deuxièmement, bien que les régions RNAP qui effectuent la catalyse et établissent les interactions clés avec les acides nucléiques soient universellement conservées Chez l’homme, les enzymes nucléaires eucaryotes sont insensibles aux inhibiteurs de la RNAP bactérienne Même parmi les bactéries, les RNAP varient considérablement en raison des contraintes imposées par les réseaux de régulation élaborés qui ajustent le programme d’expression génique aux signaux environnementaux; Troisièmement, RNAP effectue plusieurs réactions enzymatiques et interagit avec un grand nombre de régulateurs, fournissant de nombreuses cibles potentielles pour l’interférence par les antibiotiques Enfin, les rifamycines, une classe d’inhibiteurs de la RNAP découvert & gt ; Il reste que les rifamycines restent la seule classe d’inhibiteurs de la RNAP dans la pratique médicale. En outre, leur efficacité et leur polyvalence sont limitées par l’augmentation rapide de la pharmacocinétique. bactéries résistantes, parce que leur site de contact sur la sous-unité β est situé dans une région relativement dispensable Les antibiotiques qui diffèrent par leurs sites de liaison sur l’enzyme et le mécanisme d’inhibition sont donc nécessaires de manière urgente.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Établissement de RNAP comme une cible de FDX

En raison de la similitude dans la structure FDX aux structures de LPR , on s’attendait à ce qu’ils partagent la même cible Nous avons trouvé que FDX inhibait à la fois RNAP isolée de C difficile par la méthode de Pich et Bahl et RNAP d’Escherichia coli dans un essai d’incorporation d’uridine triphosphate radiomarqué Bien que l’enzyme E coli RNAP soit moins sensible que l’ARNp de C difficile, les deux enzymes sont efficacement inhibées par FDX. Un travail mécaniste a été réalisé avec l’enzyme de E. coli. mutagenèse et purification de protéines recombinantes

Mécanisme RNAP

Pendant la phase d’initiation du cycle de transcription Figure A, le noyau RNAP, un complexe de sous-unités α-dimères, β, β ‘et combines, se combine avec un facteur de spécificité promoteur σ pour localiser et se lier à une région promotrice de l’ADN, puis sépare, ou fait fondre, l’ADN double brin pour former un complexe promoteur ouvert RPo dans lequel la bulle de transcription de la région fondue s’étend des positions – par rapport au site de départ de la transcription Le nucléotide nucléoside triphosphate Lorsque la RNAP ajoute un nucléotide à une chaîne d’ARN en croissance, elle avance sur le modèle d’ADN, répétant ce cycle des centaines ou des milliers de fois pendant la phase d’élongation jusqu’à ce qu’elle atteigne un terminateur.

Figure View largeTélécharger la diapositive A, voie d’initiation de la transcription Core ARN-polymérase RNAP; ovale gris, avec le site actif décrit comme un cercle se lie à un facteur d’initiation σ de spécificité du promoteur de nombreux qui dirige le holo RNAP résultant à un sous-ensemble de promoteurs Dans Escherichia coli, le facteur σ primaire se compose de domaines distincts numérotés -; domaines et reconnaître les – et – éléments de promoteurs “ménagers” pour former un complexe promoteur fermé, RPc, dans lequel l’ADN double brin est faiblement lié à la surface de RNAP Dans RPI, le premier intermédiaire le long de la voie, la séparation des brins d’ADN initie autour de la – position par rapport au site de départ de la transcription. La fusion se propage vers le site actif comme indiqué dans RPI, mais des complexes supplémentaires peuvent également exister dans le complexe promoteur ouvert de transcription-compétent RPo; encadré, la bulle de transcription englobe la position B, Expériences d’ordre d’addition Fidaxomicin FDX; La fraction de l’ARN synthétisé a été mesurée en pourcentage de transcription en l’absence de l’antibiotique. L’inhibition de la réaction a été observée lorsque le FDX a été ajouté avant les étapes et, mais pas ou, après formation du RPo Abréviations: [αP] GTP, α-radiomarqué GTP; ApU, Adenylyl ‘-‘ uridine; ApUpCpG, produit de réaction tétranucléotidique; CTP, cytidine triphosphate; FDX, la fidaxomicine; GTP, guanidine triphosphate; RPo ★, complexe ouvert stabilisé par l’addition d’une amorce dinucléotidique ApUFigure View largeTélécharger la diapositiveA, voie d’initiation de la transcription Core ARN polymérase RNAP; ovale gris, avec le site actif décrit comme un cercle se lie à un facteur d’initiation σ de spécificité du promoteur de nombreux qui dirige le holo RNAP résultant à un sous-ensemble de promoteurs Dans Escherichia coli, le facteur σ primaire se compose de domaines distincts numérotés -; domaines et reconnaître les – et – éléments de promoteurs “ménagers” pour former un complexe promoteur fermé, RPc, dans lequel l’ADN double brin est faiblement lié à la surface de RNAP Dans RPI, le premier intermédiaire le long de la voie, la séparation des brins d’ADN initie autour de la – position par rapport au site de départ de la transcription. La fusion se propage vers le site actif comme indiqué dans RPI, mais des complexes supplémentaires peuvent également exister dans le complexe promoteur ouvert de transcription-compétent RPo; encadré, la bulle de transcription englobe la position B, Expériences d’ordre d’addition Fidaxomicin FDX; La fraction de l’ARN synthétisé a été mesurée en pourcentage de transcription en l’absence de l’antibiotique. L’inhibition de la réaction a été observée lorsque le FDX a été ajouté avant les étapes et, mais pas ou, après formation du RPo Abréviations: [αP] GTP, α-radiomarqué GTP; ApU, Adenylyl ‘-‘ uridine; ApUpCpG, produit de réaction tétranucléotidique; CTP, cytidine triphosphate; FDX, la fidaxomicine; GTP, guanidine triphosphate; RPo ★, complexe ouvert stabilisé par l’addition d’un amorce dinucléotidique ApU

Expériences d’ordre d’addition

Dans ces essais, l’antibiotique est ajouté à une RNAP libre ou à des complexes de transcription fixés à différents points de contrôle lorsque l’enzyme contourne la phase sensible à la libération de l’antibiotique. inhibiteur, il devient résistant à son action Antibiotiques qui inhibent la transcription du bloc d’élongation de la chaîne d’ARN lorsqu’il est ajouté à n’importe quelle étape pendant la transcription; ce groupe comprend Streptolydigin , tagetitoxin , microcin J et CBR un groupe d’inhibiteurs synthétiques de l’ARN polymérase, qui sont des hybrides de rifamycine-quinolone Rifampicine et sorangicine bloquent l’extension de courts transcrits ne peut plus agir lorsque l’ARN naissant croît plus longtemps que nt LPR et myxopyronines MYX, comme la déméthylmyxopyronine dMYX , inhiber RNAP seulement si ajouté avant la formation du RPo Nous avons constaté que FDX inhibe également la transcription seulement si ajouté avant le Un point commun d’action ne prouve pas le même mécanisme Au cours de l’initiation et de l’élongation, des complexes de transcription existent dans de nombreux états interconvertis qui sont différentiellement sensibles aux régulateurs cellulaires et aux antibiotiques. Ces états ont été particulièrement bien caractérisés dans le cours d’initiation lorsque plusieurs complexes promoteurs se forment séquentiellement, culminant en RPo

MYX en tant que modèle initial et région de commutation en tant que cible

En plus du comportement similaire de FDX, LPR et dMYX dans les expériences d’ordre d’addition, les modèles de mutations qui confèrent une résistance à FDX, LPR et dMYX se chevauchent, suggérant un site similaire de liaison / action sur le RNAP FDX et LPR n’inhibe pas les ARNP de Thermus, les seules enzymes bactériennes pour lesquelles des informations structurales détaillées sont actuellement disponibles. Cependant, les structures de dMYX en complexe avec RNAP de Thermus thermophilus révèlent que l’antibiotique se lie à et modifie radicalement la conformation d’un élément sous-unité β ‘appelé Des études structurelles ont suggéré que cet élément pourrait jouer un rôle important dans la transcription. Premièrement, le commutateur β ‘forme une charnière qui relie les “pinces” de la “pince” de la pince de crabe RNAP ; L’ouverture de ces pinces est supposée nécessaire pour charger l’ADN dans la RNAP pendant l’initiation. Deuxièmement, le commutateur β ‘interagit avec le brin d’ADN matrice et détermine sa position. En conséquence, des modèles ont été proposés pour expliquer l’inhibition par le dMYX. mouvements du commutateur β ‘, bloquant l’ouverture de la pince Dans un autre, le repliement stabilisé dMYX du commutateur β’ bloque stériquement le trajet du brin d’ADN matrice près du site actif RNAPAnalyse de mutants résistants au dMYX in vivo et in vitro validés L’analyse par empreintes a révélé que le dMYX n’empêche pas la liaison de l’ADN à E coli RNAP ou la nucléation de l’ADN fondant par la sous-unité σ. Cependant, le dMYX bloque la propagation de l’ADN vers le site actif. , dont l’existence a été postulée depuis de nombreuses années Sur la base de la structure complexe, nous avons conçu des substitutions dans le commutateur β ‘qui imitait le dMY La conformation liée à l’X même en l’absence de l’antibiotique; ces enzymes mutantes étaient hypersensibles à dMYX et étaient bloquées dans le même complexe promoteur inactif intermédiaire d’intérêt, DksA, une protéine régulatrice dans E coli, inhibe la transcription par des changements similaires dans les interactions RNAP / ADN, et les substitutions dans le β ‘switch – altèrent le réponse de l’enzyme à DksA Switch- est donc une cible populaire pour les inhibiteurs de la RNAP, et les substitutions résistantes au LPR suggèrent initialement que LPR et basé sur des similitudes structurelles, aussi FDX peut agir de manière similaire au dMYX Par exemple, la même substitution, β ‘RA , confère une résistance aux antibiotiques et aussi au FDX Cependant, une étude de Tupin et al a révélé des différences importantes entre LPR et dMYX. Tupin et al ont d’abord démontré que LPR agit à une étape précédant celle ciblée par dMYX. En présence de LPR, RNAP s’est lié à l’ADN du promoteur pour former un complexe instable, mais aucune séparation de brin n’a pu être détectée. Deuxièmement, cette étude a suggéré un rôle clé pour la sous-unité σ dans l’action LPR: délétion de la boucle σ en épingle à cheveux qui est positionnée près de la résistance conférée par le commutateur β ‘à LPR Ainsi, bien que les sites de liaison pour LPR et dMYX puissent partiellement se chevaucher, leurs mécanismes semblent être distincts En outre, il restait à déterminer si FDX agissait De même que LPR, en particulier parce que ces antibiotiques ciblent le commutateur hautement dynamique et leur action pourrait être fortement influencée par des différences même subtiles entre les échafaudages d’inhibiteur, la source de RNAP, et les complexes de transcription utilisés pour l’analyse

Analyse de l’empreinte pour comparer MYX, LPR et FDX

Des analyses d’empreintes ont été effectuées avec FDX pour évaluer si FDX se comportait comme LPR Similaire à LPR et contrairement à dMYX, FDX a inhibé la fusion de l’ADN dans les complexes promoteurs dans la région entourant le site de démarrage de la transcription. que FDX non seulement induit des changements dans les interactions d’ADN en aval avec la RNAP comme le font dMYX et LPR, mais aussi modifié la conformation de l’ADN dans la région d’espacement des complexes touchés LPR Contrairement à LPR, l’action FDX n’a ​​pas été altérée par la boucle σ en épingle à cheveux La source de ces différences reste à déterminer Une possibilité est qu’elles soient attribuables aux différents promoteurs utilisés pour ces analyses, λ PR dans notre travail et PlacUV dans Tupin et al

Le FDX inhibe la séparation des brins d’ADN dans les complexes promoteurs La fusion de l’ADN promoteur a été sondée par empreinte au permanganate à simple impact. Le permanganate de potassium KMnO modifie les résidus de thymidine T simple brin qui sont ensuite clivés par la pipéridine; les positions de clivage indiquent l’emplacement des régions d’ADN monocaténaire Un fragment d’ADN du promoteur λPR linéaire marqué en bout de chaîne a été généré par réaction en chaîne par polymérase Haut, Les – et – hexamères sont indiqués par des cases noires, le point de départ des résidus T du brin -, -, – et non-matrice à la modification de KMnO sont résumés au-dessus de la séquence; les flèches noires et blanches indiquent une réactivité élevée et basse, respectivement inférieure, un gel représentatif avec les résidus sensibles montrés; Les résultats montrent que bien que la myxopyronine ne bloque que l’ADN qui fond près du site de départ en position, FDX réduit la séparation des brins dans toute la région sensible avec la RNAP de type sauvage, mais pas avec un mutant. qui porte une substitution RA dans la région de commutation β ‘Abréviations: Ab, antibiotique; FDX, la fidaxomicine; MYX, myxopyronine; RNAP, ARN polymérase; La FDX inhibe la séparation des brins d’ADN dans les complexes promoteurs La fusion de l’ADN du promoteur a été sondée par empreinte de permanganate à simple impact. Le permanganate de potassium KMnO modifie les résidus de thymidine T simple brin qui sont ensuite clivés par la pipéridine; les positions de clivage indiquent l’emplacement des régions d’ADN monocaténaire Un fragment d’ADN du promoteur λPR linéaire marqué en bout de chaîne a été généré par réaction en chaîne par polymérase Haut, Les – et – hexamères sont indiqués par des cases noires, le point de départ des résidus T du brin -, -, – et non-matrice à la modification de KMnO sont résumés au-dessus de la séquence; les flèches noires et blanches indiquent une réactivité élevée et basse, respectivement inférieure, un gel représentatif avec les résidus sensibles montrés; Les résultats montrent que bien que la myxopyronine ne bloque que l’ADN qui fond près du site de départ, le FDX réduit la séparation des brins dans toute la région sensible avec la RNAP de type sauvage, mais pas avec un mutant. qui porte une substitution RA dans la région de commutation β ‘Abréviations: Ab, antibiotique; FDX, la fidaxomicine; MYX, myxopyronine; RNAP, ARN polymérase; WT, RNAP de type sauvage présente une cible complexe d’inhibition, et des changements dans l’enzyme ou l’antibiotique peuvent conférer des différences substantielles. De petits changements dans la structure antibiotique peuvent altérer les contacts avec l’enzyme et modifier le point d’inhibition comme illustré par les rifamycines. Les substitutions RNAP naturelles dans différentes enzymes bactériennes confèrent des propriétés cinétiques distinctes et une sensibilité altérée aux effecteurs cellulaires et aux antibiotiques. Certains de ces changements altèrent la liaison d’un ligand à l’ARNP, mais d’autres agissent indirectement en altérant la conformation de l’enzyme. réponse à l’antibiotique Par exemple, un sous-ensemble de mutations CBR-résistantes dans rpoC confère une dépendance à l’inhibiteur pour la croissance des souches mutantes , indiquant que leurs phénotypes ne peuvent pas être expliqués par la perte de liaison CBR Ainsi, les phénotypes de toute résistance les mutations doivent être interprétées avec prudence car certaines d’entre elles pourraient avoir une allusion indirecte Cela peut être particulièrement fréquent pour les antibiotiques qui se lient aux sites clés sur l’ARNP, où les substitutions provoqueraient des défauts de croissance. Cette complexité exige que lorsque cela est possible, l’analyse structurale des complexes antibiotiques / transcription devrait être poursuivie en parallèle avec Les études fonctionnelles sont utiles pour identifier les différences de mécanisme, en particulier parce qu’elles peuvent fournir des informations sur la dynamique de l’inhibition enzymatique plutôt que de se concentrer sur une image statique de la liaison. Les études mécanistiques présentées ici confirmer qu’il existe plusieurs étapes qui sont des cibles pour l’inhibition de la RNAP par différents antibiotiques, et FDX inhibe une étape distincte des inhibiteurs d’élongation, tels que la streptolydigine, et des inhibiteurs d’initiation MYX et les rifamycines La différence de mécanisme par rapport aux rifamycines soutient les résultats antérieurs de l’absence de croix-résis d’antibiotiques et suggère que le développement rapide de la résistance observée avec les rifamycines n’indique pas une perte rapide de susceptibilité au FDX.

Remarques

Supplément de parrainage Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé «Fidaxomicine et l’approche évolutive du traitement de l’infection à Clostridium difficile», parrainé par Optimer Pharmaceuticals, IncPotential conflits d’intérêts IA a reçu une subvention de recherche d’Optimer Pharmaceuticals JS et PS sont employés of Optimer PharmaceuticalsTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels de conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués