Nouveaux 2-aminobenzamides comme agents antithrombotiques oralement actifs potentiels

Thrombose veineuse profonde, myocardique

l’infarctus, l’embolie pulmonaire et l’AVC ont été les plus fréquents

causes de morbidité et de mortalité dues aux troubles cardiovasculaires.1 Bien que la thrombose joue un rôle important

dans le développement des maladies cardio-vasculaires, la disponibilité de

les médicaments antithrombotiques sûrs sont limités. Le besoin clinique non satisfait de

un anticoagulant sûr et actif par voie orale a entraîné une propagation

efforts de découverte de médicaments dans cette direction. Prévention de la coagulation sanguine

est une cible majeure pour de nouveaux agents thérapeutiques. Le facteur Xa (fXa) est un

serine protease trypsinlike qui forme un complexe de prothrombinase avec

facteur Va, Ca2 + et phospholipides pour produire de la thrombine.

L’enzyme clé fonctionne à la convergence de l’intrinsèque et extrinsèque

voies de coagulation dans un processus qui implique l’amplification du signal.

Une molécule de fXa active de nombreuses molécules de prothrombine en thrombine.2 Comme l’inhibition de fXa empêche la formation de thrombine

sans affecter la thrombine préexistante, les inhibiteurs de fXa sont prédits

pour provoquer moins d’altération de l’hémostase que les inhibiteurs directs de la thrombine,

la découverte d’oralement actif, petite molécule compétitive

Les inhibiteurs du fXa dans les modèles de thrombose animale préclinique ces dernières années

a stimulé le processus de découverte de molécules telles que antithrombotique

drogues. Le dérivé de benzamidine (1) a montré

activité anticoagulante orale prolongeant le temps de prothrombine (TP) plus

Les thiophènes / anthranilamides substitués par le benzothiophène (2) ont été signalés comme nouveaux et puissants inhibiteurs du fXa humain.5 Les N, N-dialkylamidines à base d’anthranilamide ont été rapportées comme étant disponibles par voie orale.

inhibiteurs puissants de fXa.6 Darexaban (YM150),

un 1,4-diazépanylbenzamide (3), a été revendiquée

un inhibiteur puissant et oral de la fXa. Le puissant pouvoir distinctif

l’activité de l’inhibiteur (3) après administration orale a été expliquée

par son profil pharmacocinétique unique et sa perméabilité membranaire favorable.

Fait intéressant, certains analogues du benzoylaminobenzoate substitué en position 2 (4) ont montré une puissance 200 fois supérieure à celle de l’agrégation antiplaquettaire

agents que l’aspirine.7 Une revue de la littérature

carboxamides et anthranilamides révélés posséder soit inhibiteur fXa

l’activité ou l’activité d’agrégation antiplaquettaire.8 Betrixaban (5), un dérivé d’anthranilamide, est un

inhibiteur de la fXa actif par voie orale prouvé utile dans la prévention de la thrombo-embolie

événements.9 Il a subi une clinique humaine

essais pour la prévention de l’embolie après chirurgie et prévention du genou

d’AVC suite à une fibrillation auriculaire, 10 avec des résultats prometteurs.11 Prendre du bétrixaban

(5) en tant que molécule principale, il était prévu de remplacer

les deux azotes avec divers substituants alkyle / aryle pour fournir

composés de type A et pour évaluer les composés synthétisés

pour leur efficacité antithrombotique. Il a été révélé plus tôt que

certains composés présentant une activité antithrombotique in vitro très élevée

échoué à produire l’effet désiré lorsqu’il est administré par voie orale. Comme

les composés conçus (A) devaient posséder antiplaquettaire

et / ou l’activité anticoagulante, il faudrait une batterie de vitro

tests à effectuer pour évaluer les composés pour ces activités.

Pour l’activité antiplaquettaire, les composés doivent être évalués contre

une multitude d’agonistes comme ADP, AA, PMA, {“type”: “entrez-nucleotide”, “attrs”: {“text”: “A23187”, “term_id”: “833253”, “term_text”: “A23187” }} A23187, collagène et thrombine.

Des tests séparés doivent être effectués pour anticoagulant et thrombolytique

activités autant de protéases sont impliquées dans l’activation de la coagulation

Cascade. De plus, il est difficile de tester des échantillons hydrophobes

le méthanol / DMSO ne peut pas être utilisé pour la solubilisation de ces échantillons

comme les deux solvants sont des inhibiteurs puissants de l’activation plaquettaire.

Réalisant la complexité du problème, il était prévu d’évaluer

efficacité antithrombotique des composés synthétisés après administration orale

comme cela montrerait l’effet global des composés sur les plaquettes

ainsi que la cascade de la coagulation après absorption orale. Donc, un simple,

modèle animal fiable et reproductible a été utilisé pour évaluer l’antithrombotique

activité des composés synthétisés dans le travail actuel. Saignement

le temps a été utilisé comme paramètre pour avoir une idée de leur effet sur l’hémostase

à une dose particulière.Dans la présente étude, il était prévu de synthétiser

une nouvelle série de 2-aminobenzamides en substituant la position 2-amino

et l’azote amidique avec des groupements alkyle et aryle hydrophobes.

La voie suivie pour la préparation de tels dérivés (8) est décrite dans le Schéma 1.Schéma 1Synthèse

des dérivés de 2-aminobenzamideContribution nucléophile de l’anhydride isatoïque

(6) dans la diisopropyléthylamine (DIPEA) et le diméthylacétamide

(DMA) avec des halogénures d’alkyle appropriés a donné l’anhydride isatoïque N-substitué

(7a – d). Les dérivés N-alkylés

(7) sur le traitement avec des amines primaires dans le DMF et le

Le carbonate de potassium à 80 ° C a donné le produit désiré (8a & w02013; w), mais il a fallu 8 heures pour compléter

la réaction. On a observé plus tôt que le chauffage du mélange réactionnel

à 110 – 120 ° C dans le toluène fourni la quinazolinone cyclique

dérivés (9) principalement. Donc, en augmentant la température

du mélange réactionnel comme moyen de diminuer le temps de réaction

a été exclu. Auparavant, 12 nous avons utilisé

un mélange de liquide ionique: diméthylsulfoxyde (IL: DMSO) (1:10) avec succès

comme solvant pour la substitution nucléophile sur un charbon actif.

Nous avons pensé à explorer ce protocole vert et simple pour ce qui précède

ladite réaction sur des anhydrides isatoïques substitués (7).

A notre grande surprise, le protocole a très bien fonctionné à température ambiante

pour produire les produits quantitativement. Bien qu’il y avait une possibilité

de formation de produits (9 ou 10), aucun

de ces produits secondaires indésirables ont été formés. Bromure de dibutylimidazolium

([bbim] + [Br] −) a été utilisé comme IL dans ces

protocoles. Tous les composés synthétisés ont été caractérisés en utilisant

IR, RMN 1H et MS. La pureté des composés a été établie

par CCM et analyse élémentaire. Des expériences ont été menées pour évaluer

les effets in vivo des composés synthétisés sur les antithrombotiques

activité, 13 temps de saignement, 14 et PT15 chez la souris. Les composés

ont été mis en suspension dans une solution aqueuse à 0,5% de CMC (carboxyméthylcellulose sodique)

et administré par voie orale. La warfarine en tant que composé de référence a été testée

dans les mêmes conditions, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. Sur l’ensemble des composés évalués pour l’activité,

12 composés ont montré une activité antithrombotique de 40% ou plus,

les composés restants ont présenté une activité entre 20 et 40% mycose. Le plus

prometteur était le composé 8g, montrant antithrombotique

une protection de 48% (la warfarine dans des conditions similaires a montré une protection de 50%),

mais en contradiction avec la warfarine, 8 g présentaient une faible prothrombine

11,2 min contre 118,2 min pour la warfarine, ce qui suggère que

le mécanisme des composés nouvellement synthétisés pourrait être différent.

Ensuite, nous avons évalué ces composés en utilisant l’aspirine comme médicament standard,

et les résultats sont présentés dans le tableau 2. Neuf

des composés (8g, 8h, 8i, 8j, 8s, 8t, 8u, 8v et 8x) ont montré des antithrombotiques comparables

activité à l’aspirine de la drogue standard. La tolérabilité du subaigu

traitement avec les composés a été examiné en évaluant leurs effets indésirables

effet pro-hémorragique sur le temps de saignement de la queue. Encore une fois, le composé 8g est apparu comme le plus prometteur, car en plus

à montrer une protection de 42%, il n’a pas augmenté la tendance hémorragique

sensiblement par rapport à l’aspirine à son antithrombotique optimale

dose. Bien que les autres composés actifs aient montré une bonne protection,

ils ont également provoqué une augmentation du temps de saignement, ce qui était un inconvénient. Table 1Ex Vivo Assay of 2-Aminobenzamide

Dérivés pour l’activité antithrombotique, le temps de saignement et la prothrombine

Temps après 3 jours de traitement à une dose de 30 μ M / kg * Tableau 2Ex Vivo Assay de nouveaux 2-aminobenzamides

pour l’activité antithrombotique ainsi que le temps de saignement après 1 h de

Traitement à une dose de 30 μ M / kg L’étude de toxicité in vivo a également été réalisée pour

composés 8g, 8h, 8j et 8v. Pour tous les composés d’essai (8g, 8h, 8j et 8v), la DL50 s’est avérée être de 2000 mg / kg.Comme fXa est responsable de

l’activité thrombotique en fin de compte, il a été pensé d’étudier la liaison

interactions des composés actifs en utilisant la 3D cristallographique

structure de fXa. fXa a un site actif bien identifié avec principalement

quatre régions reconnues. Il a S1, S2, S4, et une poche de liaison d’ester

(EBP) dans l’espace de liaison actif. Parmi ceux-ci, les sites S1 et S4 sont

plus important pour la liaison du ligand et présentant l’activité biologique.

S2 est une petite poche séparée de S4 par Tyr 99.16 Des études d’amarrage de précision supplémentaire (XP) ont été réalisées pour

les composés à l’étude. Pour valider les études d’amarrage

sous l’outil Glide de l’environnement Schr ö dinger 200917, la molécule cocristallisée (B) présente dans la structure 3D de fXa (Code PDB: 4A7I) a d’abord été cognée

hors du site de liaison. La molécule a été reconstruite, minimisée en énergie,

et redocked dans le site actif de l’enzyme. Interactions très similaires

ont été observés entre la molécule redocked et l’enzyme, comme était

observé dans la structure cocristallisée d’origine, c’est-à-dire

orientations des groupes dans les poches de liaison S1 et S4 et reliure

des interactions avec Tyr-228, Gln-192 et Gly-216 ont été observées. le

déviation racine-moyenne-carré entre la conformation prédite et

la conformation d’origine du composé B tel qu’il existait

dans la structure cristallographique des rayons X a été trouvé à 0,26 Å .Les interactions intermoléculaires d’amarrage des plus actifs

le composé (8g) est représenté sur la figure ​ Il est clairement observé que l’occupation des sites S1 et S4 par des

les fonctionnalités lipophiles sont très importantes pour une plus grande affinité de liaison

des ligands avec l’enzyme. Pour établir le mécanisme probable

l’orientation des molécules synthétisées, les interactions intermoléculaires

de la molécule de plomb betrixaban ont été comparés aux interactions d’amarrage

du composé le plus actif (8g). Dans le composé 8g, le cycle phényle du groupe N-benzyle

la poche S1, indiquant une bonne interaction lipophile, tandis que dans le bétrixaban,

le cycle pyridine montre une interaction similaire en plus de la non covalente

interaction lipophile entre − Cl de pyridine et π -système

de Tyr-228 de poche S1. Ici, − Cl est placé 3.8 Å un moyen

du centre de l’anneau aromatique Tyr-228. L’amino NH du composé 8g stabilise le complexe en formant une liaison hydrogène avec − C = O

de Gly-219 (1,8 Å), tandis que dans le bétrixaban, l’amide pyridine

NH stabilise le complexe par liaison hydrogène avec − C = O

de Gly-219 (2.1 Å) et avec la liaison disulfure de Cys-191 et

Cys-220 (2.4 et # x000c5;). Le composant méthoxyphényle du composé 8g s’adapte dans la poche de liaison S4 avec le centroïde au centroïde

distances de 4,6, 4,3 et 5,1 Å à partir du cycle phényle du méthoxybenzyle

fragment aux cycles aromatiques de Tyr-99, Trp-215 et Phe-174, respectivement.

L’amide − C = O de notre ligand (8g) interagit

avec NH de Gln-192 en formant une liaison hydrogène (2,26 Å), tandis que

dans le cas du bétrixaban, la partie N, N-diméthylcarbamimidoyl benzoyle se loge dans la poche de liaison S4

avec des distances de centroïde à centroïde de 4,47, 5,60 et 6,35 Å

entre l’anneau aromatique de cette partie et les anneaux aromatiques de Tyr-99,

Trp-215 et Phe-174, respectivement. De cette partie de betrixaban,

le − C = O et NH de l’amide montre une interaction de liaison hydrogène

avec NH de Gln-192 (2,35 Å) et − C = O de Gly-216

(1,90 Å), respectivement. Figure 1Composé 8g ancré dans l’actif

site de fXa (pointeurs A et B montrant la liaison H avec Gln-192 et Gly-219,

respectivement) .Par ailleurs, pour corréler les affinités structurelles

de composé B co-cristallisé, de bétrixaban et de 8 g, les efficacités des ligands (LE) ont été calculées. Les LE de B, Betrixaban et 8g ont été trouvés à 0,22,

0,29 et 0,29 respectivement, ce qui a encore renforcé l’efficacité

de 8g pour fXa, car les valeurs LE de betrixaban et 8g sont exactement les mêmes.Un coup d’oeil sur le tableau 1 révèle que les substituants alkyle à la fois des azotes

[Amine NH (R1) et amidique NH (R2)] offrent des composés (8o, 8p, 8q et 8r) ayant

temps de saignement mais une activité antithrombotique médiocre. Ceci est en consonance

avec les études d’amarrage dans lesquelles de mauvaises interactions des deux

des groupes alkyle dans les poches S1 et S4 ont été observés. Remplacement du

groupes alkyle à l’amidique “ N ” ou l’amine “ N ”

benzyle / benzyle substitué (8a, 8b, 8d, 8e, 8f, 8k, 8m, 8s, 8t, 8u, 8v et 8x) conduit à une augmentation de l’antithrombotique

activité avec une amélioration modérée à élevée du temps de saignement. Substitution

des groupes alkyle sur les deux azotes avec benzyle / substitué

les groupes benzyle ont présenté des composés (8g, 8h, 8i et 8j) avec une activité antithrombotique améliorée.

Ces deux observations sont soutenues par les études d’amarrage. Simultané

substitution des deux azotes par benzyle / benzyle substitué

groupe donne des composés ayant de bien meilleures interactions avec l’enzyme

dans les deux poches de liaison vitales S1 et S4. Substituant 4-méthoxybenzyle

(8g) à l’azote d’amide avec un groupe benzyle (R1) à l’amine

l’azote est responsable d’une augmentation de l’activité antithrombotique

avec un effet négligeable sur PT. Remplacement du 4-méthoxyphényle par

anneau phényle halo-substitué a maintenu l’activité antithrombotique

dans les composés résultants (8h, 8i et 8j), mais il a conduit à augmenter le temps de saignement aussi. Parmi

les dérivés halo, le dérivé fluoro (8j) offert

le meilleur profil d’activité biologique. Aux fins de comparaison

étude, composé 8l (18) ayant

substituants benzyle aux deux azotes ont été synthétisés et biologiquement

évalué. Dans les études d’amarrage également, il a été observé qu’un lipophile

substituant en position 4 du cycle benzyle amidique était essentiel

interaction lipophile dans la poche S4 de l’enzyme avec le ligand.

Il semble que la substitution benzyle / benzyle substitué à la place d’alkyle / cycloalkyle

groupes à amidic “ N ” (8a, 8b, 8s, 8t, 8u, 8v et 8x) a un impact plus profond sur antithrombotique

activité que la substitution du groupe benzyle sur amino “ N ”

(8e, 8f et 8k). C’est intéressant

de noter que le composé 8g nouvellement rapporté n’a pas causé

une augmentation du temps de saignement ou PT en désaccord avec l’aspirine ou la warfarine

à des doses antithrombotiques, tout en conservant presque le même antithrombotique

activité comme la warfarine. Ces observations soulignent que le dérivé 8g a le potentiel de fournir une meilleure fenêtre thérapeutique

sur la warfarine et l’aspirine.En résumé, une série de roman 2-aminobenzamide

dérivés ont été synthétisés et évalués par voie orale pour antithrombotique

activité en utilisant la warfarine et l’aspirine comme médicaments standard. Amarrer

des études ont été effectuées avec fXa pour établir un mécanisme prospectif

d’action des composés synthétisés en tant qu’inhibiteurs potentiels de

fXa. Certains des composés présentaient une meilleure activité que la référence

drogues. Fait intéressant, le composé le plus puissant 8g semble

posséder un profil de risque potentiellement élevé, tel qu’il était

trouvé pour être équipotent aux médicaments standard warfarin et aspirine

en tant qu’agents antithrombotiques ayant une tendance hémorragique moindre.