Première isolation de Mimivirus chez un patient atteint de pneumonie

Contexte Mimiviridae Mimivirus, y compris les plus grands virus connus, se multiplient chez les amibes Mimivirus ont été associés à la pneumonie, mais ils n’ont jamais été isolés chez les patients Pour mieux comprendre le rôle pathogène de ces virus, nous visons à les isoler d’un patient présentant des pneumonies. Les auteurs ont utilisé une technique améliorée pour l’isolement de Mimivirus, qui utilisait des plaques de gélose où la croissance de virus géants est révélée par la formation de plaques de lyse sérologie du Mimivirus. a été testé par microimmunofluorescence et par analyse immunoprotéomique bidimensionnelle en utilisant des souches Mimivirus pour identifier des protéines immunoréactives spécifiques. Le nouveau séquençage du génome de la souche Mimivirus a été réalisé sur Roche GS FLX Titanium, puis AB SOLiD instrumentsResults Nous avons isolé avec succès un LAM Mimivirus. Humain échantillon, d’une femme âgée présentant une pneumonie La microscopie électronique a révélé un virion de type Mimivirus avec une taille de ± nm Le génome de LBA est des mégabases, et il est étroitement lié à celui de Megavirus chilensis En outre, le sérum du patient a réagi Les résultats présentés ci-dessus avec des travaux antérieurs établissent que les mimivirus peuvent être associés à une pneumonie. La présence fréquente de ces virus dans l’eau et le sol en fait des agents globaux probables digne d’enquête

Mimivirus, virus géant, pneumonie, virus humain L’importance des virus géants infectant les amibes en cas de pneumonie a déjà été étudiée. Acanthamoebapolyphaga mimivirus, le premier isolat de la famille des Mimiviridae, a été isolé à partir d’amibes libres Acanthamoeba polyphaga dans une tour de refroidissement à Bradford, Angleterre, et a été échantillonné au cours de l’enquête d’une épidémie de pneumonie inexpliquée Ces amibes libres ont déjà été utilisés pour cultiver Legionella pneumophila Nous avons découvert plus tard que c’était le plus grand virus jamais isolé , et nous ont déjà décrit son génome -megabase De plus, nous avons trouvé que des souris inoculées avec Mimivirus développent une pneumonie et que le virus est détecté dans les tissus pulmonaires Mimivirus a également été montré pour infecter des macrophages humains groupes de patients atteints de pneumonie Nous avons trouvé des niveaux plus élevés d’anticorps spécifiques de Mimivirus dans les groupes suivants: comp Nous avons également documenté le cas d’un patient, notre technicien manipulant le Mimivirus. Nous avons également documenté le cas d’un patient, notre technicien manipulant Mimivirus. Enfin, nous avons détecté une séroconversion contre le virophage de Mimivirus chez des patients du Laos, qui ont mangé du poisson cru du Mékong . La détection de l’ADN de Mimivirus dans des échantillons respiratoires de patients atteints de pneumonie a été détectée. Nous pensons que la discordance entre les études PCR sérologiques et de polymérase en chaîne est due à la grande diversité génétique des mimivirus malgré une réactivité croisée entre les isolats . Enfin, nos données antérieures suggèrent que Mimivirus pourrait être un agent de la pneumonie, mais pour répondre aux critères de Koch post Pour mieux comprendre le rôle pathogène de ce virus, nous avons cultivé des échantillons d’une cohorte de patients tunisiens atteints de pneumonie.

PATIENTS ET MÉTHODES

Les patients

Des échantillons respiratoires, y compris des aspirations bronchiques, des lavages broncho-alvéolaires, des biopsies pulmonaires et des échantillons pleuraux, ont été prélevés chez des patients tunisiens atteints de pneumonie communautaire au cours de la période considérée – Un diagnostic de pneumonie a été posé. le moins des symptômes suivants: toux, production d’expectoration, une température> ° C, les résultats auscultatoires compatibles avec la pneumonie, une concentration de protéine C-réactive & gt; mg / L, et un nombre de globules blancs & gt; × cellules / L ou & lt; × cellules / L Les échantillons respiratoires ont été utilisés principalement pour les tests bactériologiques standard, et les matériaux restants des échantillons ont été utilisés dans cette étude. Le consentement éclairé écrit a été obtenu des patients ou des membres de la famille. de l’échantillon restant a été stocké à – ° C en Tunisie, et il a ensuite été expédié à ° C à Marseille, où il a été conservé à – ° C jusqu’au moment de la culture

Isolement par la coculture avec un polyphaga cultivé en agar

La délicatesse de nos méthodes habituelles nous a conduit à développer une technique d’agar s’inspirant d’une stratégie précédemment utilisée pour isoler le phycodnavirus d’une monocouche d’algues. Dans cette stratégie, les plaques détectées étaient le résultat de la lyse des cellules hôtes par le virus Tout d’abord, la rupture mécanique des cellules des échantillons respiratoires a été réalisée en les passant à travers des seringues de diamètre mm bioMérieux, Marcy l’Etoile, France Des échantillons ont ensuite été inoculés, comme décrit précédemment , dans une étape “enrichissement” avec des amibes pendant des heures. Une solution de litre de milieu PAS a été mélangée à de la g agar. Organiques de recherche Cette solution a été stérilisée à ° C pendant des minutes dans un autoclave. Un mélange antibiotique contenant μL de ciprofloxacine μg / mL; Panpharma, ZI, Clairay, France, μL de vancomycine μg / mL; Mylan, Saint-Priest, France, μL de colimycine IU / mL; Sanofi Aventis, Paris, France, μL de rifampicine μg / mL; Sanofi Aventis et μL de fungizone μg / mL; Bristol-Myers Squibb, Rueil-Malmaison, France a été ajouté au milieu avant solidification. Cinquante millilitres de milieu ont été distribués dans des boîtes de Petri carrées de × cm Dominique Dutscher, Brumath, France Après solidification et refroidissement à température ambiante, suspensions de mL de A Des polyphaga à une concentration finale d’amibes / mL ont été étalés uniformément sur la surface de la plaque d’agar. Une fois séchés, nous avons ajouté μL de la culture “d’enrichissement” décrite ci-dessus à des intervalles réguliers sur toutes les plaques. ont été incubés à ° C dans une chambre humide et examinés à des heures pour la détection des plaques de lyse. Cette technique permet le criblage des seuls échantillons positifs à la plaque Un témoin positif de surnageant de co-culture de Mimivirus et une goutte témoin négative de PAS ont été utilisés

Figure Vue largeDisque de téléchargementVisualisation de plaques de lyse sur une plaque de gélose recouverte de Acanthamoeba polyphaga, en présence de virus LBA A et de contrôle négatif BC, coloration LBA au rouge de ruthénium par microscopie électronique à transmissionFigure Voir grandDisplatir des plaques de lyse sur une plaque de gélose recouverte d’Acanthamoeba polyphaga, en présence du virus LBA A et contrôle négatif BC, coloration LBA au rouge de ruthénium par microscopie électronique à transmission

Caractérisation de l’isolat de virus

Les périphéries des plaques ont été utilisées pour les cultures d’amibes en milieu liquide Après la lyse des amibes, les surnageants ont été utilisés pour le clonage viral par dilution au point final , et μL de la suspension virale a été préparé pour la microscopie électronique. du Mimivirus a été extrait de μL de surnageant de culture avec une méthode d’extraction phénol-chloroforme. L’ADN a été préparé pour le séquençage du génome entier, comme décrit précédemment Le génome du virus a été initialement pyroséquencé en utilisant un protocole apparié. Titanium, comme indiqué précédemment Le génome a ensuite été séquencé sur un instrument AB SOLiD Life Technologies Corp, Carlsbad, Californie Les lectures de pyroséquençage ont été assemblées de novo puis cartographiées sur les génomes avec le logiciel Newbler Assembly Les lectures SOLiD ont été cartographiées génome avec le logiciel CLC Bio http: // wwwclcbiocom / indexphpid = La prédiction de gène a été réalisée en utilisant GeneMarkS , Prodigal , et Prokka http: // bioinformatics L’annotation du génome a été réalisée en comparant le résultat au génome de Mimivirus le plus proche disponible par la meilleure stratégie BLAST bidirectionnelle Des comparaisons ont également été faites par des recherches BLAST contre son protéome, le protéome d’autres membres de Mimiviridae. Pour la construction de l’arbre de phylogénie, les séquences d’ADN polymérase de la famille B ont été alignées puis découpées à l’aide de TrimAl avec des paramètres automatisés Les arbres résultants ont ensuite été vérifiés manuellement L’arbre phylogénétique a été construit à l’aide de PhyML. paramètres par défaut à l’exception des paramètres bootstrap, où la valeur -b a été définie

Analyse sérologique et PCR

Le sérum du cas positif a été obtenu des mois après l’infection. Ce sérum a été testé par microimmunofluorescence en utilisant l’antigène LBA comme antigène, ainsi que les échantillons sériques de donneurs de sang. Le sérum a également été testé par immuno-protéomique bidimensionnelle , en utilisant à la fois le Mimivirus et le Une nouvelle souche pour identifier des protéines immunoréactives spécifiques Rétrospectivement, nous avons testé des échantillons cliniques restants avec une PCR conçue sur la base de notre nouveau génome de souche en utilisant un système sonde-amorce ciblant la protéine de capside du groupe C de Mimiviridae Les amorces utilisées étaient CE-_Left ‘CCA ATG ACC TAT CGT TGG- ‘et CE-_Rig’ TAT TTT ATA TTC AAC ACC AAG G- ‘, et sonde CE__Pb FAM-CTTGGTCTAACAACCAAACACTA-TAMRA et l’échantillon restant des patients positifs avec des agents de la pneumonie atypique Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydiophila psittaci et Chlamydia pneumoniae comme indiqué

RÉSULTATS

Nous avons testé les aspirations bronchiques, les lavages broncho-alvéolaires, les biopsies pulmonaires et les ponctions pleurales. Après avoir analysé ces échantillons, nous avons réussi à isoler, à partir d’une aspiration bronchique, un virus géant qui a généré une plaque de lyse. virion avec une taille de ± nm Figure et avec une couche dense de fibrilles Le patient avec LBA était une femme âgée de -un âge hospitalisé avec des antécédents de fièvre d’un jour qui était associée à la toux, la dyspnée et l’hémoptysie. Elle était diabétique et souffrait de hypertension artérielle et insuffisance cardiaque Une radiographie thoracique a montré une consolidation du lobe inférieur droit. Elle a présenté une hyperleucocytose / mm et un taux de sédimentation accru en première heure D’autres examens étiologiques par hémoculture, fibroscopie et culture standard d’un échantillon bronchique ont montré des résultats négatifs. La pneumonie atypique testée sur notre cas était négative. Finalement, elle a été traitée avec de la lévofloxacine pendant des semaines. d elle a montré lentement des signes de récupération

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveThermographie du patient montrant la consolidation du lobe inférieur droitFigure View largeTélécharger DiapositiveChirurgie du patient présentant une consolidation du lobe inférieur droitLe sérum du patient, ainsi qu’une collection de donneurs de sang sains, ont d’abord été testés par micro-immunofluorescence en utilisant le LBA comme antigène La réactivité était faible, avec un titre de: pour le sérum du patient Figure supplémentaire; Pour confirmer la réactivité du sérum du patient et étudier la relation étroite entre le Mimivirus et le LBA, l’immunoréactivité du sérum du patient a été testée en effectuant un Western blot contre les protéines Mimivirus et LBA. Le sérum du patient réagit fortement avec les taches protéiques de LBA, dont on a trouvé qu’elles correspondaient à des protéines LBA spécifiques de LBA; LBA_; LBA_; LBA_; LBA_; LBA_; LBA_; LBA_; et LBA_ Le sérum a également réagi avec la protéine de capside Mimivirus L et l’oxydoréductase de type GMC putative R Figure Aucun des échantillons testés, excepté celui du patient permettant la culture avec LBA, n’était positif avec la PCR conçue sur notre nouveau génome de souche

Figure Vue largeDownload slideTypes d’immunoblot bidimensionnels du sérum du patient contre le virus LBA et les protéines Mimivirus Les protéines virales μg ont été résolues en valeurs pI allant de à dans la première dimension, suivies par électrophorèse en gel d’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. Les protéines ont ensuite été détectées par coloration à l’argent A et C pour le virus LBA et Mimivirus, respectivement ou transférées sur une membrane de nitrocellulose et sondées avec le sérum du patient à: dilution B et D pour virus LBA et Mimivirus, respectivement taches protéiques immunoréactives flèches et noms de locus ni: non identifié Les tailles de poids moléculaire standard sont indiquées sur la gauche en kilodaltons KDaFigure View largeTélécharger diapositives Modèles d’immunoblot bidimensionnels du sérum du patient contre le virus LBA et les protéines de Mimivirus Les protéines virales μg ont été résolues en valeurs pI qui variaient de à dans la première dimension, suivez Les protéines ont ensuite été détectées par coloration à l’argent A et C pour le virus LBA et le Mimivirus, respectivement ou transférées sur une membrane de nitrocellulose et sondées avec le sérum du patient à: dilution B et D pour le virus LBA et Mimivirus, respectivement Les taches protéiques immunoréactives sont indiquées en utilisant les flèches et les noms de locus ni: non identifié Les tailles de poids moléculaire standard sont indiquées à gauche en kilodaltons KDa La taille du génome de LBA est les paires de base chilensis Figures et Un fragment à peu près nucléotidique situé à l’extrémité du génome de la LBA n’est pas colinéaire à celui de M chilensis. La fin de ce fragment contient approximativement des nucléotides absents chez M chilensis, et la partie centrale de ce Ce fragment correspond au gène M de Mimivirus. L’extrémité correspond à des gènes situés à l’extrémité du chromosome M De plus, les premières paires approximativement de base du génome de M chilensis sont partiellement trouvées dans une orientation inversée à la fin du génome de LBA. Un total de gènes codant pour des protéines est prédit en composant des paires de meilleurs hits récurrents BLAST avec M gènes chilensis La longueur moyenne de ces paires alignées est des acides aminés, et leur identité moyenne est de%. Dans l’ensemble, les meilleures correspondances des protéines% LBA et% étaient aux protéines M chilensis et aux protéines Mimivirus / Mamavirus, respectivement. ARNt supplémentaires pour l’histidine et la cystéine par rapport à celui de M chilensis Le numéro d’accès GenBank pour le génome de LBA est JX

Figure Vue largeDownload slideCarte du chromosome du virus LBA Les anneaux allant de l’anneau externe vers l’anneau le plus interne correspondent aux coordonnées du génome en kilobases et aux gènes prédictifs codant pour la protéine, orientés dans le bleu rouge ou le rouge inverse. qui correspondent à des fragments de Mimivirus ciblés par des essais de réaction en chaîne par polymérase dans des études précédentes Mismatches entre les amorces et la sonde utilisée haut, souligné et les séquences génomiques de Mimivirus milieu et bas LBA sont montrés rouge police Dashes indiquent des nucléotides identiques en comparaison avec les amorces ou sonde; astérisques indiquent les nucléotides non contigus dans les séquences LBAFigure Vue largeTélécharger la lameCartes du chromosome du virus LBA Les anneaux commençant par l’anneau externe vers l’anneau le plus interne correspondent aux coordonnées du génome en kilobases et aux gènes codant la protéine prédits, orientés vers l’avant ou vers l’arrière. identifier les régions dans le génome LBA qui correspondent à des fragments de Mimivirus ciblés par des tests de réaction en chaîne par polymérase dans des études précédentes Mismatches entre les amorces et la sonde utilisée haut, souligné et les séquences génomiques de Mimivirus milieu et bas LBA sont montrés rouge police Dashes indiquent des nucléotides identiques dans comparaison avec les amorces ou la sonde; astérisques indiquent des nucléotides non-contigus dans les séquences LBA

Figure Vue largeTélécharger la lameComparaison et alignement génique des génomes du virus LBA et Megavirus chilensis en utilisant le logiciel Mauve http: // asapahabswiscedu / mauve / Blocs avec des contours colorés entourent les régions de la séquence du génome qui alignés à des parties de l’autre génome Les barres colorées à l’intérieur Les régions qui sont inversées par rapport à l’autre génome sont décalées en dessous de l’axe central du génome. Voir grandDownload slideComparaison et alignement génique des génomes du virus LBA et de Megavirus chilensis en utilisant Mauve logiciel http: // asapahabswiscedu / mauve / Les blocs avec des contours colorés entourent les régions de la séquence du génome qui s’alignent sur les parties de l’autre génome Les barres colorées à l’intérieur des blocs illustrent le niveau de similarité des séquences. inversé par rapport à l’autre génome sont décalés en dessous du cente r axe du génome

Vue de la figure largeDownload reconstruction de la chylogeny basée sur la famille de la famille BBA ADN polymérase blanche, fond noir est présent dans la lignée Mimivirus C, avec Megavirus chilensis, Courdo , et Courdo fond grisFigure Voir grandDownload reconstruction de la chylogénie basée sur la famille blanche-B ADN polymérase LBA blanche, fond noir est présent dans la lignée Mimivirus C, avec Megavirus chilensis, Courdo , et Courdo fond gris

DISCUSSION

Dans ce travail, nous avons isolé pour la première fois un LBA Mimivirus de l’échantillon de broncho-aspiration d’un patient humain atteint de pneumonie. Le génome viral complet a été séquencé et a révélé que LBA appartient au même clade C des Mimiviridae que M chilensis et Courdo En effet, comme sa séquence génomique est originale, la possibilité qu’elle soit le produit d’une contamination par un autre virus cultivé en laboratoire est éliminée. Le LBA est le troisième plus grand génome viral jamais isolé et représente le plus grand génome viral jamais isolé chez l’homme. De plus, les échantillons de sérum ont montré une réactivité contre des protéines LBA uniques, confirmant l’infection du patient. Le rôle des virus géants des amibes dans la pathologie humaine est resté controversé. Un corps d’arguments convergents a suggéré que ces virus pourraient agir comme une forme de pneumonie. sens parce que les virus géants d’amibes vivent dans la même niche écologique que L pneumophila, ce qui suggère que l’exposition L ‘pneumonie est comparable et l’ amibe peut agir comme un cheval de Troie pour les virus géants. Actuellement, des preuves directes de la pathogénicité de Mimivirus dans la pneumonie n’ont été démontrées que dans une seule étude où l ‘ADN du Mimivirus a été détecté dans le bronchoalvéolaire. fluide d’un patient Nous avons testé si les amorces et les sondes utilisées pour détecter Mimivirus dans des échantillons respiratoires humains dans des études précédentes [,, -] pouvaient s’hybrider avec le génome du virus LBA Nous avons trouvé que le nombre médian de mésappariements était Figure; Par conséquent, il est peu probable que ces amorces amplifient ce virus. En revanche, le LBA réagit avec les anticorps Mimivirus et le patient présente des anticorps contre le Mimivirus et le LBA. Ce résultat suggère que la discordance entre les études sérologiques et les études de PCR est causée par le variabilité génétique des membres de Mimiviridae malgré une antigénicité commune De plus, les études de métagénomique virale constituent généralement une première étape de filtration qui élimine les virus géants et excluent donc ces agents Le patient présentait une forme typique de pneumonie qui ne peut être distinguée La réponse clinique était spontanément, quoique lentement, favorable, comme dans notre cas index Cependant, la récupération retardée peut dépendre ou non d’une défaillance antibiotique, étant donné les infiltrations pulmonaires considérables. chez une femme âgée avec des comorbidités significatives Cette étude est préliminaire et ne nous permet pas de sp Nous considérons que l’isolement d’un Mimivirus du fluide broncho-alvéolaire d’un patient atteint de pneumonie dans la présente étude suggère un rôle pour les mimivirus. comme agents occasionnels de l’infection humaine Dans les articles précédents, nous avons décrit l’identification de lectures métagénomiques similaires à l’ADN de Mimivirus et Marseillevirus, suivie de l’isolement d’un nouveau virus de Marseille des selles d’un jeune homme sain vivant dans le Sénégal rural. que des virus géants de protistes phagotrophiques peuvent être récupérés à partir d’échantillons humains En outre, une revue de la littérature et des recherches supplémentaires par notre équipe ont détecté des séquences similaires à Megavirales ADN et homologues des gènes de ces virus dans les métagénomes humains. dans ce journal concernant la preuve du rôle putatif de Mimivirus dans les maladies humaines, nous avons conclu que la prochaine étape pour l’impliquer dans la pneumonie humaine devrait être l’isolement d’un virus d’un échantillon humain Ceci est ce que nous rapportons dans la présente étude Ainsi, avec les résultats négatifs concernant la culture et la PCR pour d’autres pathogènes et l’anticorps spécifique réponse, il suggère fortement que le patient souffre de pneumonie Mimivirus Après le rapport précédent d’une infection associée à la séroconversion chez un technicien de laboratoire et un modèle expérimental de la souris de pneumonie avec isolement du virus des tissus de l’animal infecté, l’isolement de Mimivirus chez un patient contribue à remplir les critères des postulats de Koch et nous convaincre que Mimivirus devrait être inclus comme pathogène humain potentiel provoquant occasionnellement des infections pulmonaires Le présent rapport, comme des preuves croissantes de l’occurrence commune de ces virus dans l’eau et le sol , soutient leur rôle en tant qu’agents globaux dignes d’investigation

Remarques

Soutien financier Cette étude a été soutenue par la Fondation Infection Méditerranée Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués |

Récupération initiale et rebond du botulisme de colonisation intestinale de type F après administration d’antitoxine botulique Heptavalent expérimentale